Sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per l'analisi dell'interazione proteina-proteina di membrana
Summary
Presentato qui è un protocollo per la determinazione dello stato oligomerico delle proteine di membrana che utilizza un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa in combinazione con la microscopia elettronica.
Abstract
Le interazioni proteina-proteina nei sistemi a membrana cellulare svolgono un ruolo cruciale in un’ampia gamma di processi biologici, dalle interazioni cellula-cellula alla trasduzione del segnale; dal rilevamento dei segnali ambientali alla risposta biologica; dalla regolazione metabolica al controllo dello sviluppo. Informazioni strutturali accurate sulle interazioni proteina-proteina sono cruciali per comprendere i meccanismi molecolari dei complessi proteici di membrana e per la progettazione di molecole altamente specifiche per modulare queste proteine. Sono stati sviluppati molti approcci in vivo e in vitro per il rilevamento e l’analisi delle interazioni proteina-proteina. Tra questi l’approccio della biologia strutturale è unico in quanto può fornire informazioni strutturali dirette sulle interazioni proteina-proteina a livello atomico. Tuttavia, l’attuale biologia strutturale delle proteine di membrana è ancora in gran parte limitata ai metodi a base di detergenti. Il principale svantaggio dei metodi a base di detergenti è che spesso dissociano o denaturano i complessi proteici della membrana una volta che il loro ambiente bistrato lipidico nativo viene rimosso dalle molecole di detergente. Abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle a membrana cellulare nativa per la biologia strutturale delle proteine di membrana. Qui, dimostriamo l’uso di questo sistema nell’analisi delle interazioni proteina-proteina sulla membrana cellulare con un caso di studio dello stato oligomerico di AcrB.
Introduction
Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale in tutta la biologia, dal mantenimento della struttura e della funzione delle proteine alla regolazione di interi sistemi. Gli IPP sono disponibili in molte forme diverse e possono essere classificati in base ai tipi di interazioni che formano. Una di queste categorizzazioni è omooligomerica o eterooligomerica, basata sul fatto che le interazioni siano tra subunità identiche o proteine diverse che agiscono come subunità. Un’altra categorizzazione si basa sulla forza dell’interazione se le interazioni portano alla formazione di complessi stabili o stati complessi transitori. Le informazioni strutturali sugli IPP tra le proteine sono cruciali per comprendere il meccanismo con cui le proteine svolgono la loro funzione. È stato stimato che oltre l’80% delle proteine si basa su una formazione complessa al fine di svolgere i loro ruoli funzionali1. Data la percentuale di proteine osservate che dipendono dagli IPP per un corretto funzionamento innato, il loro significato in biologia è facilmente evidente, ma essere in grado di indagare correttamente le proteine che si impegnano in queste interazioni è rimasto impegnativo a causa dei limiti nelle tecniche disponibili per osservare sperimentalmente quando le proteine formano IPP.
C’è un alto grado di disaccordo tra i risultati per molti IPP determinati sperimentalmente a causa dell’elevata quantità di rumore, falsi positivi e falsi negativi che derivano da molte delle tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili. Ciò è particolarmente vero per il sistema bi-ibrido di lievito (Y2H), la spettrometria di purificazione di purificazione tandem-massa (TAP-MS) e il trasferimento di energia di risonanza a fluorescenza (FRET), che rappresentano tre dei metodi più comunemente utilizzati per la determinazione PPI2,3,4,5,6,7. In confronto, le tecniche di biologia strutturale delle proteine, come la risonanza magnetica nucleare (NMR), la cristallografia a raggi X e la microscopia elettronica (EM), possono essere utilizzate per ottenere informazioni strutturali ad alta risoluzione sulle interazioni proteina-proteina fino al livello atomico e consentire la conferma visiva diretta delle interazioni che si verificano per una proteina bersaglio di interesse. Tutte le tecniche di ricerca di determinazione PPI non basate sulla struttura attualmente disponibili (ad esempio, Y2H, TAP-MS e FRET) mancano di questa capacità e soffrono inoltre di difficoltà nell’identificare interazioni deboli e transitorie tra proteine5. Queste carenze sono ulteriormente migliorate quando si studiano le proteine di membrana a causa della complessità aggiunta portata dalla variabile aggiuntiva dell’ambiente lipidico che influenza la formazione di una corretta struttura quaternaria e assemblaggio complesso eteromerico.
Le proteine di membrana covano gran parte del proteoma e sono note per svolgere molti ruoli cruciali nel corretto funzionamento cellulare all’interno di tutti gli organismi viventi. Nonostante si stima che le proteine di membrana costituiscano il 27% del genoma umano e costituiscano ~ 60% di tutti gli attuali obiettivifarmacologici,c’è una grande anomalia nel numero di modelli risolti per le proteine di membrana che costituiscono solo ~ 2,2% di tutte le strutture proteichepubblicate 8,9,10. La causa principale della discrepanza nella disponibilità di informazioni strutturali risiede nelle proprietà intrinseche delle proteine di membrana stesse. A causa della loro scarsa solubilità, della dipendenza dalle interazioni con un ambiente lipidico per mantenere la struttura e la funzione nativa e di varie proprietà fisicochimiche della membrana lipidica stessa, le proteine di membrana continuano a rappresentare un problema sostanziale quando implementano tecniche di biologia strutturale per studiarle. Di queste proprietà intrinseche, la più importante per ottenere informazioni strutturali accurate è il requisito di avere interazioni con il loro ambiente lipidico naturale per mantenere la loro struttura e funzione nativa. L’ambiente lipidico è parte integrante della struttura e della funzione delle proteine di membrana che il concetto di memteina (una combinazione delle parole membrana e proteina) è stato proposto come unità fondamentale della struttura membrana-proteina e dellafunzione 11. Nonostante l’importanza delle interazioni lipidico-proteina, le tecniche di determinazione PPI attualmente disponibili a base di struttura spesso richiedono che le proteine studiate siano solubili o solubilizzate con detergenti. L’esposizione a detergenti aggressivi può denaturare le proteine o causare falsi positivi e negativi a causa della delipidazione, che può indurre aggregazione, denaturazione delle proteine, dissociazione di interazioni non covalenti e formazione di stati oligomerici artificiali. A causa della necessità di mantenere un ambiente lipidico naturale per una determinazione accurata dello stato oligomerico nativo delle proteine di membrana abbiamo sviluppato un sistema di nanoparticelle di membrana a cellule native (NCMN)12 basato sul metodo Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)13 precedentemente riportato.
SMALP utilizza il copolimero dell’acido maleico stirene come polimero attivo di membrana per estrarre e solubilizzare le proteine della membrana. Il poli(acido stirene-co-maleico) (SMA) è un polimero anfifilo unico per la sua moietà di stirene idrofobica e la moietà dell’acido maleico idrofilo diametralmente opposta. Forma nanoparticelle adsorbendo, destabilizzando e interrompendo la membrana cellulare in un meccanismo dipendente dal pH14. Questa attività funzionale di SMA è ciò che consente di utilizzarla come sistema privo di detergenti per l’estrazione e la solubilizzazione delle proteine di membrana. Il sistema NCMN è distinto dal sistema SMALP sotto diversi aspetti. La caratteristica più unica del sistema NCMN è che ha una libreria di polimeri attivi a membrana con una moltitudine di polimeri che hanno proprietà uniche che li rendono adatti all’isolamento di molte diverse proteine di membrana che richiedono condizioni diverse per la stabilità e il funzionamento nativo. Il sistema NCMN ha anche protocolli diversi rispetto al metodo SMALP quando si tratta di preparare le nanoparticelle. Uno di questi esempi è che gli NCMN utilizzano una purificazione della colonna di affinità al nichel a passo singolo per la determinazione della struttura ad alta risoluzione; l’effetto di questi diversi protocolli può essere osservato quando si confronta il protocollo NCMN, che ha generato strutture crio-EM AcrB 3.2 e 3.0 Å, con uno studio simile utilizzando il metodo SMALP, che ha portato a una struttura crio-EM AcrB con una risoluzione 8.8 Å12,15. Queste caratteristiche uniche del sistema NCMN sono i miglioramenti apportati al metodo SMALP precedentemente stabilito e lo rendono un candidato ideale per lo studio degli IPP.
Il trasportatore multifarmaco Efflux AcrB esiste come omotrimero funzionale in E. coli12. Un’analisi mutagena ha suggerito che una singola mutazione puntino P223G, situata su un circuito responsabile della stabilità del trimer AcrB, destabilizza lo stato del trimer e produce un monomero AcrB quando preparato con il detergente DDM, che potrebbe essere rilevato con elettroforesi del gel blu nativo16. Tuttavia, l’analisi FRET del mutante AcrB-P223G suggerì che quando nell’ambiente bistrato lipidico della membrana cellulare nativa, la maggior parte dell’AcrB-P223G mutante esisteva ancora come trimestre e che i livelli di espressione sia per il tipo selvaggio AcrB che per L’AcrB-P223G sono simili. Tuttavia, nonostante i risultati dell’analisi FRET, un test di attività per il trasportatore mutante ha mostrato che l’attività è diminuita drasticamente rispetto al tiposelvaggio 16. Sebbene la tecnologia FRET sia stata popolarmente utilizzata per l’analisi delle interazioni proteina-proteina, la ricerca ha dimostrato che può spesso dare falsi positivi17,18,19,20.
Recentemente, sono state determinate strutture crio-EM ad alta risoluzione del trimer AcrB che hanno mostrato l’interazione di AcrB con il suo bistrato lipidico a membrana cellulare nativa associata attraverso l’uso delle NCMN12. In linea di principio, gli NCMN possono essere facilmente utilizzati per l’analisi delle interazioni proteina-proteina trovate sulla membrana cellulare nativa. In un test di questo sistema, sono stati effettuati esperimenti per osservare direttamente lo stato oligomerico di AcrB-P223G con l’uso di nanoparticelle di membrana cellulare nativa e microscopia elettronica di colorazione negativa. Al fine di confrontare con le nanoparticelle AcrB di tipo selvatico, abbiamo utilizzato lo stesso polimero attivo a membrana (SMA2000 realizzato nel nostro laboratorio, che è indicizzato come NCMNP1-1 nella libreria NCMN) utilizzato per la determinazione della struttura crio-EM ad alta risoluzione di AcrB e polimeri alternativi trovati nella libreria NCMNs12. Sulla base dei risultati precedentemente riportati, ci si aspettava che la maggior parte del mutante AcrB-P223G esistesse sotto forma di nanoparticelle di membrana cellulare nativa trimerica21. Tuttavia, nel campione non sono stati trovati trimer AcrB, come quelli osservati con il tipo selvaggio AcrB. Ciò suggerisce che la maggior parte dell’AcrB-P223G non forma trimer sulla membrana cellulare nativa come suggerito in precedenza.
Qui riferiamo un’analisi dettagliata del mutante E. coli AcrB-P223G in confronto al tipo selvatico E. coli AcrB utilizzando le NCMN. Questo caso di studio dell’AcrB suggerisce che gli NCMN sono un buon sistema per l’analisi dell’interazione proteina-proteina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le interazioni proteina-proteina sono importanti per l’integrità della struttura e della funzione delle proteine di membrana. Sono stati sviluppati molti approcci per studiare le interazioni proteina-proteina. Rispetto alle proteine solubili, le proteine di membrana e i loro IPP sono più difficili da studiare a causa delle proprietà intrinseche uniche delle proteine di membrana. Questa difficoltà deriva principalmente dal requisito che le proteine di membrana siano incorporate in un ambiente bistrato lipidico nativo …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata supportata dal fondo di avviamento VCU (a Y.G.) e dal National Institute Of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di premio R01GM132329 (a Y.G.) Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali degli Istituti Nazionali di Sanità. Ringraziamo Montserrat Samso e Kevin McRoberts per il loro generoso supporto per la registrazione video.
Materials
| Chemicals | |||
| 30% Acrylamide/BIS SOL (37.5:1) | Bio-Rad | 161-0158 | |
| 4x Laemmli Sample Buffer (Loading Buffer) | Bio-Rad | 1610747 | |
| Acetic Acid Glacial | ThermoFisher Scientific | A38S-212 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Bio-Rad | 161-0700 | |
| Chloramphenicol | Goldbio | C-105-5 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 protein stain powder | Bio-Rad | 161-0400 | |
| DTT (Dithiothreitol) (> 99% pure) Protease free | Goldbio | DTT10 | |
| Glycerol | ThermoFisher Scientific | G33-4 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | BP310-1 | |
| Imidazole | Affymetrix | 17525 1 KG | |
| IPTG | Goldbio | I2481C100 | |
| Kanamycin | Goldbio | K-120-25 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | ThermoFisher Scientific | AA3622636 | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | A412-4 | |
| N,N-dimethylethylenediamine (EDTA) | Merck | 8.03779.0100 | |
| NCMNS-P5-2 | Not commercially available yet | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| SMA2000 | Cray Valley | Submit request for obtaining to corresponding author | |
| Sodium Chloride | ThermoFisher Scientific | S271-10 | |
| TCEP-HCl | Goldbio | TCEP25 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| Terrific Broth Media | Affymetrix | 75856 1 KG | |
| Tris Base | Bio-Rad | 161-0719 | |
| Uranyl Acetate | Ambinter | Amb22348393 | |
| Equipment | |||
| Avanti J-26S XPI | Beckman Coulter | B14538 | |
| Avanti JXN-30 | Beckman Coulter | B34193 | |
| Carbon Electron Microscope Grids (10 nm) | Electron Microscopy Sciences | CF300-Cu-TH | |
| Con-Torque Tissue Homogenizer | Eberbach | E7265 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge | ThermoFisher Scientific | 07-203-954 | |
| EmulsiFlex-C3 | Avestin | ||
| Fraction Collector F9-R | GE Healthcare Life Sciences | 29003875 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 165-8004 | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | PN LL-IM-12AB | |
| PELCO easiGlow Glow Discharge Cleaning System | Ted Pella | 91000S-230 | |
| Potter-Elvehjem Safe Grind Tissue Grinder | Wheaton | 358013 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 164-5050 | |
| Razel R99-E Variable Speed Syringe Pump | Razel Scientific Instruments | ||
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 28990944 | |
| Tecnai F20 200kV | FEI | ||
| Type 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | ||
| General Materials | |||
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
| 4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa | Millipore Sigma | UFC803024 | |
| AKTA pure 25 L1 FPLC | GE Healthcare Life Sciences | 29018225 | |
| BL21(DE3)pLysS Cells | ThermoFisher Scientific | C606003 | |
| Falcon 50 ml Conical Centrifuge Tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | |
| HisTrap HP 5 ml Column | GE Healthcare Life Sciences | 17524802 | |
| pET-24a | EMD Biosciences | 69749-3 |
Referências
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