تصنيع مصفوفة نانوية حيوية مع الأنابيب النانوية الأساسية يانوس وليفينيكتين للتصاق الخلايا الجذعية
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار تجميع نانوماتريكس حيوي (NM) مع الأنابيب النانوية الأساسية يانوس (JBNTs) و Fibronectin (FN). عندما تشارك في الاستزراع مع الخلايا الجذعية المسكية البشرية (hMSCs)، تظهر NMs نشاطًا حيويًا ممتازًا في تشجيع الالتصاق hMSCs.
Abstract
تم تطوير NM حيويًا ليكون بمثابة سقالة بيولوجية هندسية للأنسجة ، والتي يمكن أن تعزز مرسى الخلايا الجذعية. يتم تشكيل NM الحيوية من JBNTs و FN من خلال التجميع الذاتي في محلول مائي. JBNTs قياس 200-300 μm في الطول مع قنوات جوفية الهيدربويك الداخلية والأسطح المائية الخارجية. يتم توجيه الاتهام بشكل إيجابي JBNTs والـ FNs مشحونة بشكل سلبي. لذلك، عندما حقن في حل مائي محايد، يتم ربطها معا عن طريق الترابط غير التكافؤ لتشكيل حزم NM. يتم الانتهاء من عملية التجميع الذاتي في غضون ثوان قليلة دون أي مبادرات كيميائية، مصدر الحرارة، أو الأشعة فوق البنفسجية. عندما يكون درجة النيّة المحلّل NM أقل من النقطة الأيزوكريتية لـ FNs (PI 5.5-6.0)، فإن حزم NM ستُطلق ذاتياً بسبب وجود FN مشحونة بشكل إيجابي.
ومن المعروف NM لتقليد مصفوفة خارج الخلية (ECM) شكلرفولوجي وبالتالي، يمكن استخدامها كسقالة عن طريق الحقن، والذي يوفر منصة ممتازة لتعزيز التصاق hMSC. ويشير تحليل كثافة الخلايا وتجارب التصوير المفلورة إلى أن نظم NMs زادت بشكل كبير من مرسى hMSCs مقارنة بالتحكم السلبي.
Introduction
وقد أظهرت الخلايا الجذعية mesenchymal الإنسان (hMSCs) إمكانية تجديد الذات والتمايز الذاتي على طول الأنساب mesenchymal المختلفة، مما يساعد في تجديد وصيانة الأنسجة1. وبناء على إمكانية التمايز، تعتبر hMSCs كمرشحين لإصابات الأنسجة المسكية وعلاج اضطراب الدم2. وقد أظهرت hMSCs القدرة على تعزيز التئام الجروح عن طريق زيادة إصلاح الأنسجة، الأوعية الدموية، والحد من الالتهاب3. ومع ذلك ، من دون مساعدة المواد الكيميائية الحيوية أو الحيوية ، فإن كفاءة hMSCs للوصول إلى الأنسجة المستهدفة والوظيفة في الموقع المطلوب منخفضة4. على الرغم من أن مختلف السقالات هندسيا قد استخدمت لجذب hMSCs للتمسك بالآفات، بعض المواقع مثل كسر لوحة النمو، في منتصف العظام الطويلة، لا يمكن الوصول إليها بسهولة من قبل السقالات التقليدية سابقة التصنيع، والتي قد لا تناسب تماما في موقع مصاب بشكل غير منتظم.
وقد طورنا هنا مادة نانوية ذات طبيعة حيوية يمكن أن تتجمع ذاتيا في الموقع وتحقن في منطقة يصعب الوصول إليها. وتتألف حقن الحيوي سقالة NM من نانوتيوب قاعدة جانوس (JBNTs) و Fibronectin (FN). JBNTs، والمعروف أيضا باسم الأنابيب النانوية روزيت (RNTs)، مستمدة من أزواج قاعدة الحمض النووي، وتحديدا الثيمين والأدينين، هنا5،6،7. كما رأينا في الشكل 1، تتشكل الأنابيب النانوية عند ستة جزيئات من أزواج قاعدة الحمض النووي المشتقة ذاتية التجميع عبر روابط الهيدروجين لتشكيل طائرة6. ثم يتم تكديس ستة جزيئات على بعضها البعض في طائرة عبر تفاعل قوي بين pi-stacking7، والذي يمكن أن يصل طوله إلى 200-300 ميكرومتر. تم تصميم JBNTs لتقليد ألياف الكولاجين بشكل مورفولوجي بحيث تتفاعل FN معها.
FN هو ارتفاع الوزن الجزيئية جليكوبروتين لاصقة، والتي يمكن العثور عليها في مصفوفة خارج الخلية (ECM)9. هذه يمكن أن تتوسط في تعلق الخلايا الجذعية على مكونات أخرى من ECM، ولا سيما الكولاجين10. قمنا بتصميم JBNTs لتقليد ألياف الكولاجين بشكل مورفولوجي حتى تتمكن FN من التفاعل معها لتشكيل NM في بضع ثوان عبر الترابط غير التكافؤ. لذلك، NM هو سقالة بيو واعدة ليتم حقنها في موقع كسر العظام التي لا يمكن الوصول إليها من قبل السقالات ملفقة تقليديا. هنا, NM عن طريق الحقن يقدم قدرة ممتازة لتعزيز المرسى hMSC في المختبر, عرض إمكاناتها لتكون بمثابة سقالة لتجديد الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، طورنا NM حيويًا ذاتي التجميع ، والذي تم تشكيله مع JBNTs و FN المستوحى من الحمض النووي. عند إعداد حل JBNT، ينبغي أن يذوب مسحوق التحلل JBNT في الماء بدلا من برنامج تلفزيوني لأن PBS سوف يسبب التكتل من JBNTs، الذي يمنع تجميعها. وعلاوة على ذلك، وينبغي أيضا أن يتم تجميعها في المياه NM إذا كنا نر?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل ماليا من قبل المعاهد القومية للصحة (المنح 1R01AR072027-01، 1R03AR069383-01)، NSF جائزة الوظيفي (1653702) وجامعة كونيتيكت.
Materials
| 1,2-dichloroethane | Alfa Aesar | 39121 | |
| 2-cyanoacetic acid | Sigma-Aldrich | C88505 | |
| 4-Dimethylaminopyridine | TCI America | D1450 | |
| 8 wells Chambered Coverglass | Thermo Fisher | 155409 | |
| 96-well plate | Corning | 353072 | |
| absolute ethanol | Thermo Fisher | BP2818500 | |
| acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | |
| allylamine | Sigma-Aldrich | 145831 | |
| Basic Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC32G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| concentrated hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Deionized water | Thermo Fisher | 15230147 | |
| dichloromethane | Sigma-Aldrich | 270997 | |
| diethyl ether | Sigma-Aldrich | 296082 | |
| Di-tert-butyl dicarbonate | Sigma-Aldrich | 361941 | |
| ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 319902 | |
| ethylcarbamate | Sigma-Aldrich | U2500 | |
| Fibronectin | Thermo Fisher | PHE0023 | |
| Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS) | Thermo Fisher | R37814 | |
| guanidinium hydrochloride | Alfa Aesar | A13543 | |
| hexanes | Sigma-Aldrich | 227064 | |
| Human mesenchymal stem cells | Lonza | PT-2501 | |
| methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| methyl iodide | Sigma-Aldrich | 289566 | |
| N,N-Diisopropylethylamine | Alfa Aesar | A17114 | |
| N,N-dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 227056 | |
| N-Methylmorpholine N-oxide | Alfa Aesar | A19802 | |
| Osmium tetraoxide | Alfa Aesar | 45385 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140163 | |
| Phosphate Buffer Solution | Thermo Fisher | 20012050 | |
| phosphoryl chloride | Sigma-Aldrich | 201170 | |
| potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 347825 | |
| reverse phase column | Thermo Fisher | 25305-154630 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher | R415 | |
| silica gel | TCI America | S0821 | |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| sodium ethoxide | Alfa Aesar | L13083 | |
| sodium periodide | Sigma-Aldrich | 71859 | |
| sodium sulfate | Sigma-Aldrich | 239313 | |
| sodium sulfite | Sigma-Aldrich | S0505 | |
| sodium triacetoxyborohydride | Alfa Aesar | B22060 | |
| spectrophotometer(NanoDrop One/Oneᶜ UV-Vis) | Thermo Fisher | ND-ONE-W | |
| Stem Cell Growth Medium BulletKit | Lonza | PT-3001 | |
| tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 | |
| thioanisole | Sigma-Aldrich | T28002 | |
| toluene | Sigma-Aldrich | 179418 | |
| triethylamine | Alfa Aesar | A12646 | |
| trifluoroacetic acid | Alfa Aesar | A12198 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher | 25200056 |
Referências
- Yao, W., et al. Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference. Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).
- Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).
- Hadjiargyrou, M., O’Keefe, R. J. The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease. Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).
- De Becker, A., Riet, I. V. Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy. World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).
- Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
- Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
- Fenniri, H., et al. Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization. Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).
- Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
- Van den Bogaerdt, A. J., et al. Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation. Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).
- Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand. Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).
- Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. . U. S. Patent. , (2017).
- Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage. Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).
- Singh, P., Schwarzbauer, J. E. Fibronectin and stem cell differentiation – lessons from chondrogenesis. Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).
- Martino, M. M., et al. Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability. Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).
- Somaiah, C., et al. Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells. PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).
- Ogura, N., et al. Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin. Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).
- Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. 3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications. Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).
- Shi, W., et al. Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo. Advanced Material. 29, 1701089 (2017).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells. Small. 4 (6), 817-823 (2008).
- Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo. International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).
