Doble inyección directa de sangre en la Cisterna Magna como modelo de hemorragia subaracnoidea

Summary

Describimos en este protocolo un modelo estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) mediante una doble inyección de sangre entera autóloga en la cisterna magna. El alto grado de estandarización del procedimiento de doble inyección representa un modelo de media a aguda de SAH con relativa seguridad con respecto a la mortalidad.

Abstract

Entre los accidentes cerebrovasculares, la hemorragia subaracnoidea (HS) consecutiva a la ruptura de un aneurisma arterial cerebral representa 5-9%, pero es responsable de alrededor del 30% de la mortalidad total relacionada con el accidente cerebrovascular con una morbilidad importante en términos de desenlace neurológico. Un vasoespasmo cerebral retrasado (CVS) puede ocurrir con mayor frecuencia en asociación con una isquemia cerebral retrasada. Se están utilizando diferentes modelos animales de SAH, incluyendo perforación endovascular e inyección directa de sangre en la cisterna magna o incluso en la cisterna prequismática, cada una de las que presenta ventajas y desventajas distintas. En este artículo, se presenta un modelo de ratón estandarizado de SAH mediante la inyección directa doble de volúmenes determinados de sangre entera autóloga en la cisterna magna. Brevemente, los ratones fueron pesados y luego anestesiados por inhalación de isoflurano. A continuación, el animal se colocó en una posición reclinable sobre una manta calentada manteniendo una temperatura rectal de 37 oC y se colocó en un marco estereotáctico con una curva cervical de unos 30o. Una vez en su lugar, la punta de una micropipeta de vidrio alargada llena con la sangre arterial homóloga extraída de la arteria carótida de otro ratón de la misma edad y sexo (C57Bl/6J) se posicionó en un ángulo recto en contacto con la membrana atlanto-occipital por medio de un micromaniprulador. Luego se inyectaron 60 l de sangre en la cisterna magna seguida de una inclinación descendente de 30o del animal durante 2 minutos. La segunda perfusión de sangre de 30oL en la cisterna magna se realizó 24 h después de la primera. El seguimiento individual de cada animal se lleva a cabo diariamente (evaluación cuidadosa del peso y el bienestar). Este procedimiento permite una distribución predecible y altamente reproducible de la sangre, probablemente acompañada de una elevación de la presión intracraneal que puede ser imitada por una inyección equivalente de un líquido cefalorraquídeo artificial (CSF), y representa un modelo agudo a leve de SAH que induce la baja mortalidad.

Introduction

La hemorragia subaracnoidea (SAH) representa hasta el 5% de todos los casos de accidente cerebrovascular y constituye una patología relativamente común con una incidencia de 7,2 a 9 pacientes por cada 100.000 por año, con una tasa de mortalidad del 20%-60% dependiendo del estudio^1,,2,,3. En la fase aguda, la mortalidad es atribuible a la gravedad del sangrado, sangrado, vasoespasmo cerebral (CVS) y/o complicaciones médicas⁴. En los sobrevivientes, la lesión cerebral temprana (EBI) se asocia con la extensión parénquima de la hemorragia y el aumento abrupto de la presión intracraneal, que puede resultar en isquemia cerebral primaria⁵ y la muerte inmediata en aproximadamente 10%-15% de los casos⁶. Después de la etapa inicial “aguda” de la SAH, el pronóstico depende de la aparición de isquemia cerebral “secundaria” o retardada (DCI), detectada en casi el 40% de los pacientes por tomografía computarizada cerebral, y en hasta el 80% de los pacientes después de la resonancia magnética (RM)^7,,8. Además del CVS que ocurre entre 4 y 21 días después de la ruptura del aneurisma en la mayoría de los pacientes con SAH, DCI⁹ puede ser el resultado de lesiones cerebrales difusas multifactoriales secundarias a la formación de microtrombosis, reducción de la perfusión cerebral, neuroinflamación y depresión de propagación cortical (CSD)^10,11,12,13. Esto afecta al 30% de los sobrevivientes de SAH e impacta las funciones cognitivas incluyendo memoria visual, memoria verbal, tiempo de reacción, y funciones ejecutivas, visuospatiales y del lenguaje¹⁴ deteriorando la vida diaria¹⁵. Las terapias estándar actuales para prevenir el CVS y/o los malos resultados cognitivos en pacientes con SAH se basan en el bloqueo de la señalización y vasoconstricción de Ca²⁺ mediante el uso de inhibidores del canal Ca²⁺ como nimodipina. Sin embargo, ensayos clínicos más recientes dirigidos a vasoconstricción revelaron disociación entre el resultado neurológico del paciente y la prevención del CVS^16,lo que sugiere mecanismos fisiopatológicos más complejos implicados en las consecuencias a largo plazo de la SAH. Por lo tanto, existe una necesidad médica de una mayor comprensión del número de eventos patológicos que acompañan a la SAH y el desarrollo de modelos animales válidos y estandarizados para probar las intervenciones terapéuticas originales.

La ruptura de un aneurisma intracraneal mayormente responsable de la SAH en humanos es probablemente difícil de imitar en modelos animales preclínicos. Actualmente, la ruptura del aneurisma y la situación de la SAH se pueden probar tentativamente mediante la perforación de la arteria cerebral media (modelo de punción endovascular) responsable de CVS y disfunciones sensitivomotoras en ratones^17,,18. Debido a la falta de un posible control sobre la aparición del sangrado y la difusión de la sangre en este modelo, se han desarrollado otros métodos en roedores para generar modelos SAH sin ruptura endovascular. Más precisamente, consisten en la administración directa de sangre arterial en el espacio subaracnoideo a través de una inyección única o doble en las cisternas magna¹⁹ o una sola inyección en la cisterna prequismática²⁰. La principal ventaja de estos modelos de ratón sin ruptura endovascular es la posibilidad de dominar reproduciblemente el procedimiento quirúrgico y la calidad y cantidad de la muestra de sangre inyectada. Otra ventaja de este modelo sobre el modelo mediante perforación endovascular en particular es la preservación del bienestar general del animal. De hecho, esta cirugía es menos invasiva y técnicamente menos difícil que la necesaria para generar una ruptura de la pared carótida. En este último modelo, el animal tiene que ser intubado y ventilado mecánicamente, mientras que un monofilamento se inserta en la arteria carótida externa, y avanza en la arteria carótida interna. Esto probablemente conduce a isquemia transitoria debido a la obstrucción del vaso por la trayectoria del alambre. En consecuencia, la comorbilidad (estado moribundo, dolor importante y muerte) asociada con la cirugía es menos importante en el modelo de doble inyección en comparación con el modelo de perforación endovascular. Además de ser un SAH más consistente, el método de inyección directa doble cumple con el bienestar animal en la investigación y las pruebas (tiempo reducido bajo anestesia, dolor por alteración del tejido en la cirugía y angustia) y conduce a un número total mínimo de animales utilizados para el estudio del protocolo y la formación del personal.

Además, esto permite la implementación del mismo protocolo a ratones transgénicos, lo que conduce a una comprensión patológica optimizada de la SAH y la posibilidad de pruebas comparativas de posibles compuestos terapéuticos. Aquí, presentamos un modelo de ratón estandarizado de hemorragia subaracnoidea (SAH) por una doble inyección diaria consecutiva de sangre arterial autóloga en la cisterna magna en ratones C57Bl/6J machos de 6-8 semanas de edad. La principal ventaja de este modelo es el control del volumen de sangrado en comparación con el modelo de perforación endovascular, y el refuerzo del evento de sangrado sin un aumento drástico de la presión intracraneal²¹. Recientemente, la doble inyección directa de sangre en la cisterna magna ha sido bien descrita en los problemas experimentales y fisiopatológicos en ratones. De hecho, recientemente demostramos CVS de grandes arterias cerebrales (basilar (BA), medias (MCA) y arterias cerebrales anteriores (ACA), deposición cerebrovascular de fibrina y apoptosis celular desde el día 3 (D3) hasta 10 (D10), defectos de circulación del líquido cefalorraquídeo paravascular acompañados de alteraciones de las funciones sensitivomotoras y cognitivas en ratones, 10 días después de SAH en este modelo²². Por lo tanto, hace que este modelo dominado, validado y caracterizado para eventos a corto y duradero plazo después de SAH. Debe ser ideal para la identificación prospectiva de nuevas dianas y para estudios sobre estrategias terapéuticas potentes y eficientes contra complicaciones asociadas a la SAH.

Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo la supervisión de H. Castel de conformidad con el Comité ético francés y las directrices de la Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y el Consejo para la Protección de los Animales Utilizados con Fines Científicos. Este proyecto fue aprobado por el CENOMEXA local y los comités éticos nacionales de investigación y pruebas de animales. Los ratones macho c57Bl/6J Rj (Janvier), de 8 a 12 semanas, se alojaron en condiciones ambientales estándar controladas: 22 o…

Representative Results

Cronología experimental, procedimiento, seguimiento y mortalidadLa Figura 1A y la Figura 1B resumen el protocolo modelo SAH mediante inyección de sangre de doble intracisterna. Brevemente, el primer día de inducción de SAH (D-1), se inyectaron 60 l de sangre retirada de un ratón homólogo o 60 l de líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) en la cisterna magna en SAH o en condiciones falsas, respectivamente. Al día siguiente (D0), se…

Discussion

A pesar de la intensidad de la investigación en el campo de la SAH y el desarrollo de estrategias terapéuticas como opciones de tratamiento endovascular y farmacológico que aumentan en los últimos veinte años, la mortalidad sigue siendo alta en la primera semana de ingreso hospitalario y alcanza alrededor del 50% durante los siguientes 6 meses^24,,25.. Este modelo preclínico actual mediante doble inyección diaria de sangre arterial homólo…

Materials

absorbable hemostat	Ethicon	Surgicel
absorbable suturing thread	Ethicon	Vicryl 5.0
auto-regulated electric blanket	Harvard Apparatus	50-7087-F
bluetack for capillary fixation	UHU	Patafix
electronic balance	Denver Instrument	MXX-2001
glass capillaries	Harvard Apparatus	GC150F-15	inner diameter 0.86 mm outer diameter 1.5 mm
isoflurane vaporizer	Phymep	V100
micropipette puller	Sutter Instrument Company	P-97
needle 26 G	BD microbalance	300300
non absorbable suturing thread	Peters surgical	Filapeau 4.0
stereotaxic frame	David Kopf instruments	Model 902
surgical equipment	Kent scientific	clamp, microscissors, thin scissors
syringe 20 mL TERUMO	Thermofisher	11866071