Her beskriver vi forberedelsen af rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Under en gradvis og kontrolleret afsavn af serum skildrer disse skiver udviklende epileptiske-lignende begivenheder og kan betragtes som en ex vivo-model af epileptogenese. Dette system repræsenterer et glimrende værktøj til overvågning af dynamikken i spontan aktivitet samt til vurdering af udviklingen af neuroinflammatoriske træk i løbet af epileptogenese.
Organotypic skive kulturer er blevet udbredt til model hjernesygdomme og betragtes som fremragende platforme til evaluering af et lægemiddel neurobeskyttende og terapeutiske potentiale. Organotypiske skiver fremstilles af udplantet væv og repræsenterer et komplekst flercellet ex vivo-miljø. De bevarer hjernecellernes tredimensionelle cytoarkitektur og lokale miljø, opretholder neuronale forbindelser og den neuron-glia gensidige interaktion. Hippocampal organotypiske skiver anses for egnede til at udforske de grundlæggende mekanismer i epileptogenese, men klinisk forskning og dyremodeller af epilepsi har antydet, at rhinal cortex, der består af perirhinale og entorhinale cortices, spiller en relevant rolle i anfaldsgenerering.
Her beskriver vi forberedelsen af rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver. Optagelser af spontan aktivitet fra CA3-området under perfusion med komplet vækstmedium, ved fysiologisk temperatur og i mangel af farmakologiske manipulationer viste, at disse skiver skildrer udviklende epileptiske-lignende begivenheder gennem tiden i kulturen. Øget celledød, gennem propidium jod optagelse assay, og gliose, vurderet med fluorescens-koblet immunohistochemistry, blev også observeret. Den eksperimentelle tilgang, der præsenteres, fremhæver værdien af rhinal cortex-hippocampus organotypic skivekulturer som en platform til at studere dynamikken og progressionen af epileptogenese og til at screene potentielle terapeutiske mål for denne hjernepatologi.
Epilepsi, en af de mest udbredte neurologiske lidelser på verdensplan, er kendetegnet ved den periodiske og uforudsigelige forekomst af synkroniseret og overdreven neuronal aktivitet i hjernen. På trods af de forskellige antiepileptiske lægemidler (AERD’er), der er tilgængelige, er en tredjedel af patienter med epilepsi ildfaste til terapi1 og fortsætter med at opleve anfald og kognitiv tilbagegang. Desuden hæmmer tilgængelige AED’er kognition på grund af deres relativt generaliserede handlinger på neuronal aktivitet. Epileptogenese er svært at studere hos mennesker, på grund af de mange og heterogene epileptogene skader, lange latente perioder, der varer måneder til årtier, og de vildledende virkninger af antikonvulsiv behandling efter det første spontane anfald.
Identifikation af potentielle terapeutiske midler til behandling af epilepsi er blevet mulig på grund af dyremodeller af epilepsi: 1) genetiske modeller, der anvender genetisk disponerede dyr, hvor anfald forekommer spontant eller som reaktion på en sensorisk stimulus; 2) modeller af elektrisk stimulation-inducerede anfald; og 3) farmakologiske modeller for anfald induktion, der bruger pilocarpin (en muscarinic receptor agonist), kainat (en kainate receptor agonist) eller 4-aminopyridin (en kalium kanal blocker), blandt andre. Disse modeller var afgørende for forståelsen af adfærdsændringerne samt molekylære og cellulære mekanismer, der ligger til grund for epilepsi, og de har ført til opdagelsen af mange AEDs2.
Ex vivo-præparater er også et effektivt værktøj til at udforske de mekanismer, der ligger til grund for epileptogenese og ictogenese. Akutte hippocampale skiver, som muliggør elektrofysiologiske undersøgelser af levende celler over en 6-12 timers periode, og organotypiske hippocampale skiver, der kan bevares i en inkubator over en periode på dage eller uger, er blevet flittigt brugt i undersøgelser af epileptiform aktivitet3.
Organotypiske hjerneskiver fremstilles af udplantet væv og repræsenterer en fysiologisk tredimensionel model af hjernen. Disse skiver bevarer cytoarchitecture af regionen af interesse og omfatter alle hjerneceller og deres intercellulære kommunikation4. Den mest anvendte region til langsigtede organotypiske kulturer er hippocampus, da denne region er påvirket af neuronalt tab i flere neurodegenerative tilstande. De har været meget brugt til at modellere hjernesygdomme og betragtes som fremragende værktøjer til vurdering af et lægemiddels neurobeskyttende og terapeutiske potentiale5,6. Modeller af epileptogenese, slagtilfælde og Aβ-induceret toksicitet blev beskrevet i hippocampal organotypiske skiver7,8,9,10. Parkinsons sygdom blev udforsket i ventral mesencephalon og striatum, samt cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, organotypic skiver11. Organotypic cerebellar skive kulturer efterligne mange aspekter af axon myelination og cerebellar funktioner og er en udbredt model for at undersøge nye terapeutiske strategier i multipel sklerose12.
Imidlertid har klinisk forskning og dyremodeller af epilepsi antydet, at rhinal cortex, sammensat af perirhinal og entorhinal cortices, spiller en rolle i anfald generation13. Således blev der etableret en model af epileptogenese i rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver14. Under en gradvis og kontrolleret afsavn af serum skildrer rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver udviklende epileptiske-lignende begivenheder, i modsætning til analoge skiver, der altid opbevares i et serumholdigt medium.
I epilepsi, som i mange akutte og kroniske sygdomme i centralnervesystemet, den neurocentriske vision undlader at belyse de mekanismer, der ligger til grund for sygdom debut og progression. Kliniske og eksperimentelle beviser peger på hjernebetændelse, hvor mikroglia og astrocytter spiller en relevant rolle, som en af de vigtigste aktører, der bidrager til den epileptiske proces. Farmakologiske forsøg med dyremodeller af epilepsi tyder på, at antiepileptogenic virkninger kan opnås ved at målrette proinflammatoriske veje, og i dag betragtes neuroinflammation som en ny mulighed for udvikling af terapeutiske tilgange til epilepsi15.
Her beskriver vi grundigt forberedelsen af rhinal cortex-hippocampus organotypic skivekulturer samt detaljerne til registrering af spontan epileptiform aktivitet fra dem. Vi fremhæver, at dette system efterligner flere neuroinflammatoriske aspekter af epilepsi, idet det således er egnet til at udforske gliacellernes rolle og neuroinflammation i denne patologi. Desuden udgør det en brugervenlig platform til screening af potentielle terapeutiske tilgange til epilepsi.
Dyremodeller af epilepsi har været afgørende for opdagelsen af mange AID’er, men de kræver mange dyr, og de fleste af dem er tidskrævende på grund af den latente periode for anfaldsdeponeret. Den lave magnesiuminduktion af epileptiformaktivitet i hippocampale akutte skiver er også blevet grundigt revideret i litteraturen3, men akutte skiver har en levedygtighed på 6-12 timer, hvilket gør det umuligt at vurdere langsigtede ændringer. Organotypiske skiver kan opretholdes i kultur fra dage til uger, hvilket gør det muligt at overvinde den korte levedygtighedstid for akutte skiver, og modeller af epileptogenese i organotypiske hippocampale skiver er blevet foreslået3,7,8.
Her beskriver vi forberedelsen af organotypiske skiver, der består af rhinal cortex og hippocampus. Disse skiver tager 15-20 minutter at forberede pr. Dyr, startende fra dyreofring indtil placering af skiver på indsatserne, og 6-8 skiver pr. Halvkugle kan opnås. Der skal udvises ekstra forsigtighed, når halvkuglen åbnes for at eksponere hippocampus, og når vævet fjernes fra filterpapiret efter udskæring. Overskydende væv over hippocampus kan også kompromittere skiven integritet under udskæring.
Rhinal cortex-hippocampus organotypic skiver skildrer en udviklende epileptisk-lignende aktivitet, der ligner in vivo epilepsi. Efter en uge i kultur skildrer de fleste skiver blandet interictal og i ictal-lignende aktivitet, som udvikler sig til udelukkende i ictal-lignende begivenheder med tiden i kulturen. Indtil videre har vi registreret få interictal udledninger i skiver med 2-3 uger. I dette system, epileptisk-lignende aktivitet synes at udvikle sig hurtigere end i organotypiske hippocampal skiver. Dette kan tilskrives tilstedeværelsen af rhinal cortex, som bevarer det meste af det funktionelle input til hippocampus. For fuldt ud at løse dette problem udføres der i øjeblikket en fuldstændig karakterisering af de epileptiske signaler, der vises af disse skiver gennem tiden i kulturen, såsom antallet og varigheden af i ictle begivenheder sammen med deres amplitude og frekvens.
Dette system kan opretholdes i kultur i mere end tre uger og efterligner mange molekylære korrelater af epilepsi, såsom neuronal død, aktivering af mikroglia og astrocytter og øget produktion af proinflammatoriske cytokiner14, hvilket muliggør en langsigtet karakterisering af disse aspekter. Det repræsenterer også en brugervenlig screeningsplatform, hvor farmakologiske indgreb rettet mod specifikke cellulære veje kan implementeres, og potentielle terapeutiske mål kan testes. Utvivlsomt kan systemet heri præsenteret bidrage til yderligere at oplyse mekanismerne i epileptogenese.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne anerkende Bioimaging Unit of Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, for alle forslag vedrørende billederhvervelse.
Dette projekt har modtaget støtte fra EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram i henhold til tilskudsaftale Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) gennem projekt PTDC/MEDFAR/30933/2017 og Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
Nail polish | Cliché | ||
Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
Platinum 5 blades | Gillette | ||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |