Här beskriver vi beredningen av rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Under en gradvis och kontrollerad berövande av serum, dessa skivor visar framväxande epipileptic-liknande händelser och kan betraktas som en ex vivo modell av epileptogenesis. Detta system representerar ett utmärkt verktyg för att övervaka dynamiken i spontan aktivitet, liksom för att bedöma utvecklingen av neuroinflammatoriska funktioner under epileptogenes.
Organotypiska slice kulturer har använts i stor utsträckning för att modellera hjärnsjukdomar och anses vara utmärkta plattformar för att utvärdera ett läkemedels neuroprotektiva och terapeutiska potential. Organotypiska skivor framställs av explanterad vävnad och representerar en komplex multicellulär ex vivo-miljö. De bevarar den tredimensionella cytoarchitecture och lokala miljön i hjärnceller, upprätthåller neuronal anslutning och neuron-glia ömsesidiga interaktion. Hippocampal organotypiska skivor anses lämpliga att utforska de grundläggande mekanismerna för epileptogenes, men klinisk forskning och djurmodeller av epilepsi har föreslagit att rhinal cortex, bestående av perirhinal och entorhinal cortices, spelar en relevant roll i beslag generation.
Här beskriver vi beredningen av rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor. Inspelningar av spontan aktivitet från CA3-området under perfusion med komplett tillväxtmedium, vid fysiologisk temperatur och i avsaknad av farmakologiska manipuleringar, visade att dessa skivor visar utvecklande epileptiska händelser genom tiderna i kulturen. Ökad celldöd, genom propidium iodide upptag analys och gliosis, bedöms med fluorescens-kopplade immunohistokemi, observerades också. Det experimentella tillvägagångssättet som presenteras belyser värdet av rhinal cortex-hippocampus organotypiska slice kulturer som en plattform för att studera dynamiken och progressionen av epileptogenesis och att screena potentiella terapeutiska mål för denna hjärnpatologi.
Epilepsi, en av de vanligaste neurologiska störningarna över hela världen, kännetecknas av den periodiska och oförutsägbara förekomsten av synkroniserad och överdriven neuronal aktivitet i hjärnan. Trots de olika antiepileptiska läkemedel (AEDs) som finns tillgängliga, en tredjedel av patienter med epilepsi är eldfasta till terapi1 och fortsätter att uppleva beslag och kognitiv nedgång. Dessutom hämmar tillgängliga AED kognition på grund av deras relativt generaliserade åtgärder på neuronal aktivitet. Epileptogenes är svårt att studera hos människor, på grund av de flera och heterogena epileptogenic skador, långa latenta perioder varar månader till årtionden och de vilseledande effekterna av antikonvulsiv behandling efter det första spontana beslaget.
Identifiering av potentiella terapeutiska medel för behandling av epilepsi har blivit möjlig på grund av djurmodeller av epilepsi: 1) genetiska modeller, som använder genetiskt predisponerade djur där anfall uppstår spontant eller som svar på en sensorisk stimulans; 2) Modeller av elektriska stimuleringsinducerade anfall. och 3) farmakologiska modeller av anfallsinduktion som använder pilokarin (en muscarinisk receptor agonist), kainate (en kainate receptor agonist) eller 4-aminopyridin (en kaliumkanalblockerare), bland andra. Dessa modeller var avgörande för förståelsen av beteendeförändringar, liksom molekylära och cellulära mekanismer som ligger till grund för epilepsi, och de har lett till upptäckten av många AEDs2.
Ex vivo preparat är också ett kraftfullt verktyg för att utforska mekanismerna bakom epileptogenes och ictogenesis. Akuta hippocampal skivor, som möjliggör elektrofysiologiska studier av levande celler under en 6-12 h period, och organotypiska hippocampal skivor som kan bevaras i en inkubator under en period av dagar eller veckor har använts i stor utsträckning i studier av epileptiform aktivitet3.
Organotypiska hjärnskivor framställs av explanterad vävnad och representerar en fysiologisk tredimensionell modell av hjärnan. Dessa skivor bevarar cytoarchitecture av regionen av intresse och inkluderar alla hjärnceller och deras intercellulära kommunikation4. Den mest använda regionen för långsiktiga organotypiska kulturer är hippocampus, eftersom denna region påverkas av neuronal förlust i flera neurodegenerativa villkor. De har använts ofta för att modellera hjärnsjukdomar och anses vara utmärkta verktyg för att bedöma ett läkemedels neuroprotektiva och terapeutiska potential5,6. Modeller av epileptogenes, stroke och Aβ-inducerad toxicitet beskrevs i hippocampal organotypiska skivor7,8,9,10. Parkinsons sjukdom undersöktes i ventral mesencephalon och striatum, liksom cortex-corpus callosum-striatum-substantia nigra, organotypiska skivor11. Organotypiska cerebellar slice kulturer efterliknar många aspekter av axon myelination och cerebellar funktioner och är en utbredd modell för att undersöka nya terapeutiska strategier i multipel skleros12.
Klinisk forskning och djurmodeller av epilepsi har dock föreslagit att rhinal cortex, sammansatt av perirhinal och entorhinal cortices, spelar en roll i beslag generation13. Således fastställdes en modell av epileptogenes i rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor14. Under en gradvis och kontrollerad brist på serum visar rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor framväxande epileptiska-liknande händelser, till skillnad från analoga skivor som alltid hålls i ett seruminnehållande medium.
Vid epilepsi, som i många akuta och kroniska sjukdomar i centrala nervsystemet, misslyckas den neurocentriska visionen att klargöra mekanismerna bakom sjukdomsuppkomst och progression. Kliniska och experimentella bevis pekar på hjärninflammation, där mikroglia och astrocyter spelar en relevant roll, som en av nyckelaktörerna som bidrar till epileptiska processen. Farmakologiska experiment i djurmodeller av epilepsi tyder på att antiepileptogenic effekter kan uppnås genom att rikta proinflammatoriska vägar, och numera neuroinflammation betraktas som ett nytt alternativ för utveckling av terapeutiska metoder för epilepsi15.
Här beskriver vi noggrant beredningen av rhinal cortex-hippocampus organotypiska slice kulturer, liksom detaljerna för inspelning av spontan epileptiform aktivitet från dem. Vi belyser att detta system efterliknar flera neuroinflammatory aspekter av epilepsi, är således lämplig att utforska rollen av stödjeceller och neuroinflammation i denna patologi. Dessutom representerar det en lättanvänd plattform för screening av potentiella terapeutiska metoder för epilepsi.
Djurmodeller av epilepsi har varit avgörande för upptäckten av många AEDs, men de kräver många djur och de flesta av dem är tidskrävande på grund av den latenta perioden för anfallsuppkomst. Låg magnesium induktion av epileptiform verksamhet i hippocampal akuta skivor har också reviderats grundligt ilitteraturen 3, men akuta skivor har en 6-12 h livskraft gör det omöjligt att bedöma långsiktiga förändringar. Organotypiska skivor kan bibehållas i kulturen från dagar till veckor, vilket gör det möjligt att övervinna den korta livskraftstiden för akuta skivor, och modeller av epileptogenes i organotypiska hippocampal skivor har föreslagits3,7,8.
Här beskriver vi beredningen av organotypiska skivor, bestående av rhinal cortex och hippocampus. Dessa skivor tar 15-20 min att förbereda per djur, från djuroffer till placering av skivor på skären, och 6-8 skivor per halvklot kan erhållas. Extra försiktighet måste vidtas när du öppnar halvklotet för att exponera hippocampus och när du tar bort vävnaden från filterpapperet efter skivning. Överskott av vävnad ovanför hippocampus kan också äventyra skivans integritet under skivning.
Rhinal cortex-hippocampus organotypiska skivor visar en utvecklande epileptisk-liknande aktivitet som liknar in vivo epilepsi. Efter en vecka i kultur skildrar de flesta skivor blandad interictal och ictal-liknande aktivitet, som fortskrider till enbart ictal-liknande händelser med tiden i kulturen. Hittills har vi registrerat få interictal urladdningar i skivor med 2-3 veckor. I detta system verkar epileptisk-liknande aktivitet utvecklas snabbare än i organotypiska hippocampal skivor. Detta kan hänföras till närvaron av rhinal cortex, som bevarar det mesta av den funktionella ingången till hippocampus. För att helt ta itu med det här problemet utförs för närvarande en fullständig karakterisering av de epileptiska signaler som visas av dessa segment under hela tiden i kulturen, till exempel antal och varaktighet för ictal-händelser, tillsammans med deras amplitud och frekvens.
Detta system kan upprätthållas i kultur i mer än tre veckor och efterliknar många molekylära korrelater av epilepsi, såsom neuronal död, aktivering av mikroglia och astrocyter och ökad produktion av proinflammatoriska cytokiner14, vilket möjliggör en långsiktig karakterisering av dessa aspekter. Det representerar också en lättanvänd screeningplattform, där farmakologiska interventioner riktade mot specifika cellulära vägar kan genomföras och potentiella terapeutiska mål kan testas. Utan tvekan kan systemet häri bidra till att ytterligare upplysa epileptogenes mekanismerna.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill uppmärksamma Bioimaging Unit of Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, för alla förslag om bildförvärv.
Detta projekt har fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 inom ramen för bidragsavtal Nº 952455, Fundação para a Ciênciae Tecnologia (FCT) genom Projekt PTDC/Medfar/30933/2017 och Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa.
50 mL Centrifuge Tube, Conical Bottom | Corning | 430829 | |
70% Ethanol | Manuel Vieira, Lda | UN1170 | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 900A | |
Amplifier | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
Anti-C3d (goat) | R&D Systems | AF2655 | Dilute at a ratio 1:1000 |
Anti-CD68 (mouse) | Abcam | ab31630-125ug | Dilute at a ratio 1:250 |
Anti-GFAP (mouse) | Millipore SAS | MAB360 | Dilute at a ratio 1:500 |
Anti-Iba1 (rabbit) | Abcam | ab108539 | Dilute at a ratio 1:600 |
Anti-NeuN (rabbit) | Werfen | 16712943S | Dilute at a ratio 1:500 |
Artificial cerebrospinal fluid (aCSF) | Homemade | ||
B-27™ Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
Blades for scalpel handle | Fine Science Tools | 10011-00 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | NZYTech | MB04602 | 5% BSA is used to dilute the primary antibodies. Add 0.5g BSA in 10 mL PBS. |
Brain/Tissue Slice Chamber System | Warner Instruments | ||
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1.02382.0500 | |
Cell culture inserts, 30 mm, hydrophilic PTFE | Millipore SAS | PICM03050 | |
Cold light source | SCHOTT | KL 300 LED | |
Confocal laser microscope | Zeiss | LSM 710 | |
Conventional incubator | Thermo Scientific Heraeus | BB15, Function Line | Set to 37 °C and 5% CO2 |
D(+)-Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1.08342.1000 | |
D-(+)-Glucose solution, 45% in water | Sigma | G8769 | |
di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate | Merck Milipore | 1.06580.1000 | |
Dissecting microscope/magnifier | MEIJI TECHNO CO. LTD | 122285 | |
Donkey anti-goat IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11057 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10037 | Dilute at a ratio 1:200 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | Dilute at a ratio 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) coupled to Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Dilute at a ratio 1:500 |
Dumont #5 Fine Forceps Biologie Inox | Fine Science Tools | 11254-20 | |
Dumont #5 Forceps Standard Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | |
Dumont #7 Forceps Standard Dumoxel | Fine Science Tools | 11271-30 | |
Dumont Medical #7S Forceps Short Curve Inox | Fine Science Tools | 11273-22 | |
Gentamycin stock solution, 50 mg/mL | Thermo Fisher Scientific | 15750-037 | |
Gey’s Balanced Salt Solution (GBSS) | Biological Industries | 01-919-1A | |
Glass Electrodes | Science Products | GB150F-10 | Round tips homemade |
Glass Pasteur pipettes, 230 mm | VWR International | 612-1702 | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 24020-091 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | Stock solution at 2 mg/mL in PBS |
Horse Serum, Heat Inactivated (HS) | Thermo Fisher Scientific | 26050-088 | |
Hydrochloric acid | Merck Milipore | 1.09057.1000 | |
Hydrophobic Pen | Dako | S200230-2 | |
INCU-Line IL10 | VWR | 390-0384 | |
Interface chamber | Warner Instruments | BSC-HT Haas Top | |
Iris Spatula Curved | Fine Science Tools | 10092-12 | |
Labculture Class II Biological Safety Cabinet | HERASafe | HS 12 | |
Lens Cleaning Paper | TIFFEN | ||
L-Glutamine solution 200 mM (Q) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Merck Millipore | 1.05886.0500 | |
Micro tube 0.5 mL, PP | SARSTEDT | 72,699 | |
Micro tube 1.5 mL, PP | SARSTEDT | 72.690.001 | |
Micro tube 2.0 mL, PP | SARSTEDT | 72.691 | |
Micromanipulators | Sutter Instrument | MP-285 | |
Miroscope Cover Glasses, 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 102242 | |
Nail polish | Cliché | ||
Neurobasal-A Medium (NBA) | Thermo Fisher Scientific | 10888-022 | |
Opti-MEM® I Reduced-Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
Paraformaldehyde, powder | VWR Chemicals | 2,87,94,295 | |
Peristaltic pump | Gilson | M312 | |
Phosphate saline buffer (PBS) | Homemade. PBS with 0.5% Tween-20 (PBS-T) is used to wash slices during the immunohistochemistry assay. | ||
Phosphate standard solutions, PO₄3- in water | BDH ARISTAR | 452232C | |
Pipette set | Gilson | P2, P10, P20, P100, P200, P1000 | |
Platinum 5 blades | Gillette | ||
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405-250g | |
Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-25MG | Stock solution at 1 mg/mL in water. |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 55 mm | Whatman | 1001-055 | Medium retention 11µm |
Qualitative Filter Paper, Cellulose, Grade 1, 90 mm | Whatman | 1001-090 | Medium retention 11µm |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
Slip Tip Insulin Syringe without Needle 1 mL | SOL-M | 161000 | |
Sodium chloride | VWR Chemicals | 27800.360 | |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck Millipore | 1.06346.1000 | |
Sodium hydrogen carbonate | Merck Millipore | 1.06329.1000 | |
Sodium Hydroxide | Merck Milipore | 535C549998 | |
Stimulator | Astro Med Inc GRASS Product Group | S48 Stimulator | |
Student Scissors Straight SharpSharp 12cm | Fine Science Tools | 91402-12 | |
SuperFrost Plus™ Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
TC-Treated Sterile 60 x 15mm Tissue Culture Dish | Corning | CORN430166 | |
TC-Treated Sterile 6-Wells Plates | Corning | CORN3516 | |
Temperatue controller | MEDICAL SYSTEMS CORP. | TC-102 | |
Tissue Chopper | The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD. | MTC/2 | Set to 350 μm |
Triton X-100 | BDH | 14630 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |