감마 변형 펩타이드 핵산의 자가 조립을 유기 용매 혼합물의 복잡한 나노 구조로
Summary
이 문서는 유기 용매 혼합물에서 감마 변형 펩타이드 핵산 올리고머로부터 나노 구조의 설계 및 자체 조립을 위한 프로토콜을 제공합니다.
Abstract
DNA 및 RNA 나노 기술의 현재 전략은 수성 또는 실질적으로 수화 된 매체에서 다양한 핵산 나노 구조의 자체 조립을 가능하게한다. 본 기사에서는 유일무이한 주소 지정, 단일 가닥, 감마 변형 펩타이드 핵산(γPNA) 타일의 자체 조립을 통해 유기 용매 혼합물에서 나노섬유 아키텍처를 시공할 수 있는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 각 단일 가닥 타일(SST)은 각각 6개의 베이스의 2개의 결합된 모듈형 도메인으로 구성된 12기 γPNA 올리고머이다. 각 도메인은 프로그래밍된 보완성을 사용하여 인접한 가닥에 존재하는 상호 무료 도메인에 결합하여 길이의 미크론으로 성장할 수 있는 나노 섬유를 형성할 수 있습니다. SST 모티프는 3-나선 나노 섬유의 형성을 가능하게하기 위해 9 총 올리고머로 만들어집니다. 직경 단분산 구조를 형성하는 유사한 DNA 나노 구조와 는 달리, 이러한 γPNA 시스템은 유기 용매 혼합물에서 자체 조립 중에 폭을 따라 번들되는 나노 섬유를 형성합니다. 따라서 여기에 설명된 자가 조립 프로토콜에는 번들 효과를 줄이기 위해 기존의 계면활성제인 도데실 설페이트 나트륨(SDS)도 포함됩니다.
Introduction
수많은 복잡한나노구조1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12의 수성 또는 실질적으로 수화된 세포의 성공적인 시공은 DNA1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 및 RNA11,12와 같은 자연발생적인 핵산을 사용하여 이루어진 수성 또는 실질적으로 수화된 매체로 나타났다. 그러나, 자연적으로 발생하는 핵산은 이중 백액 형성 변화를 겪거나 유기 용매혼합물(13,14)에서열성 능력을 감소시키는 것이다.
이전에는 감마-펩타이드 핵산(γPNA)15(도 1A)라고불리는 감마 위치 변형 합성 핵산 모방을 이용한 3-나선 나노섬유의 시공을 향한 방법을 보고하였다. 이러한 개발 및 합성 핵산 모방 PNA의 잠재적 인 응용에 대한 필요성은 필드 내에서 논의되었다16,17. DNA나노구조(18,19,20)에제시된 단일 가닥 타일(SST) 전략의 적응을 통해, 9개의 순차적으로 구별되는 γPNA 올리고머는 DMSO 및 DMF와 같은 일부 극성 아프로틱 유기 용매 혼합물에서 3-나선 나노섬유를 형성하도록 설계될 수 있음을 보여주었다. γPNA 올리고머는 사후 등에서공표한 방법에 기초하여 각각의 12베이스 올리고머를 따라 3개의 γ 위치(1, 4 및 8 기저 위치)에서 (R)-diethylene 글리콜(mini-PEG)을 수정하여 상업적으로 주문하였다. 21 이러한 감마 변형은 수정되지 않은 PNA에 비해 γPNA의 더 높은 결합 친화성 및 열 안정성과 관련된 헬리칼 사전 조직을 유발합니다.
본 기사는 우리가 γPNA 기반 나노 구조의 형성에 DNA와 용매 용액 및 대체의 효과를 조사하는 우리의보고 된 작업의적응이다 (15. 이 문서의 목적은 설계에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 γPNA 나노 섬유의 자체 조립 및 특성화를 위해 개발 된 용매 적응 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제공하는 것입니다. 따라서, 먼저 합성 핵산을 이용한 나노구조 설계를 위한 일반적인 플랫폼인 모듈식 SST 전략을 소개한다.
PNA 이중제의 헬리칼 피치는 10.5베이스(도1B)당1회전을 겪는 DNA 듀플렉스에 비해 턴당 18개의 베이스로 보고되었다. 따라서, 시연된 γPNA SST의 도메인 길이는 3개의 삼각형 배열 헬리액 사이의 상호 작용을 가능하게 하기 위해 전체 회전의 1/3 또는 120° 회전의 1/3을 수용하기 위해 6개의 베이스로 설정되었다. 또한, 이전 SST 모티브와 달리 각 SST에는 2개의 도메인만 포함되어 있어 3개의 나선 번들(그림1C)을형성하기 위해 랩하는 1차원 리본 모양구조를 효과적으로 만듭니다. 각 12기 γPNA 올리고머는 1, 4 및 8 위치에서 감마 변형되어 전체 SST 모티프에 걸쳐 미니 PEG 그룹의 균일간격 분포를 보장합니다. 또한, 모티프 내에서, 올리고머의 두 가지 유형이 있다: 단일 나선과 나선 에 걸쳐 “크로스 오버”가닥에 존재하는 “연속”가닥(그림 1D). 또한, 올리고머 P8 및 P6는 형광 현미경을 이용한 구조 형성의 검출을 가능하게 하기 위해각각 형광 Cy3(녹색 별) 및 비오틴(yellow oval)으로 표시되어 있다. SST 모티프는 9개의 총 올리고머로 이루어져 각 개별 도메인의 프로그래밍된 보완성을 통해 인접한 올리고머(그림1E)에해당하는 도메인에 대한 3-나선 나노섬유의 형성을 가능하게 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서는 기존 핵산 나노 기술 프로토콜을 유기 용매 혼합물에 적응하고 개선하는 데 중점을 둡니다. 여기에 설명된 방법은 선택극성 아프로틱 유기 용매의 정의된 실험 공간 내에서 수정 및 문제 해결에 중점을 둡니다. 다른 확립 된 핵산 나노 기술 프로토콜이 공간 내에서 적응 할 수있는 아직 미개척 잠재력이 있다. 이는 일반적으로 유사한 유기용매(25,2…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 국립 과학 재단 보조금 1739308, NSF 경력 보조금 1944130 및 공군 과학 연구 보조금 번호 FA9550-18-1-0199에 의해 부분적으로 지원되었습니다. γPNA 서열은 트루코드 유전자 수리, Inc.의 투물 스리바스타바 박사로부터 받은 관대한 선물이었습니다. 우리는 DNA 디자인 툴박스 MATLAB 코드에 대한 그들의 유용한 대화에 대한 에릭 윈프리 박사와 리잘 하리아디 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 조셉 수한, 마라 설리반 과 생물학적 이미징 센터가 TEM 데이터 수집에 도움을 준 것에 감사드립니다.
Materials
| γPNA strands/oligomers | Trucode Gene Repair Inc. | Section 2.1 | |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent | Varian Cary 300 | Section 3.1.2 |
| Quartz cuvettes | Starna | 29-Q-10 | Section 3.1.1 |
| Thermal cycler | Bio Rad | C1000 touch | Section 4.1 |
| 0.2 mL PCR tubes | VWR | 53509-304 | Section 4.5 |
| Anhydrous DMF | VWR | EM-DX1727-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous DMSO | VWR | EM-MX1457-6 | Section 4.6 |
| Anhydrous 1,4-Dioxane | Fisher Scientific | AC615121000 | Section 4.6 |
| 10X Phosphate Buffered Saline (PBS) | VWR | 75800-994 | Section 3.1.1 |
| Microscope slides | VWR | 89085-399 | Section 5.2 |
| Glass cover slips | VWR | 48382-126 | Section 5.2 |
| 2% Collodion in Amyl Acetate | Sigma-Aldrich | 9817 | Section 5.2 |
| Isoamyl Acetate | VWR | 200001-180 | Section 5.2 |
| Biotinylated Bovine Serum Albumin (Biotin-BSA) | Sigma-Aldrich | A8549 | Section 5.3 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | Section 5.4 |
| Streptavidin | Sigma-Aldrich | 189730 | Section 5.5 |
| Trolox | Sigma-Aldrich | 238813 | Section 5.7 |
| Total Internal Reflection Fluorescence microscope | Nikon | Nikon Ti2-E | Section 5.8 |
| Transmission Electron Microscope | Joel | JEM 1011 | Section 6.6 |
| Tweezers | Dumont | 0203-N5AC-PO | Section 6.3 |
| Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | Section 6.1 |
| Formvar, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1701-F | Section 6.2 |
| Formvar-Silicon monoxide Type A, 300 mesh, Copper grids | Ted Pella Inc. | 1829 | Section 6.2 |
| DNA oligomers/strands | IDT | Section 7.1 | |
| Sodium Dodecyl Sulphate (SDS) | VWR | 97064-860 | Section 8.1 |
Referências
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