Charakterisierung von Immunzellen und proinflammatorischen Mediatoren im pulmonalen Milieu
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung der Durchflusszytometrie, um die Veränderungen der Immunzellzusammensetzung, des Zytokinprofils und des Chemokinprofils in der pulmonalen Umgebung nach einem vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss, einem murinen Modell des ischämischen Schlaganfalls, zu identifizieren.
Abstract
Die Expansion, Aktivierung und der Transport von Immunzellen in die Lunge, die durch die Expression mehrerer Zytokine und Chemokine gesteuert werden, können durch schwere Hirnverletzungen verändert werden. Dies wird durch die Tatsache belegt, dass Lungenentzündung eine der Haupttodesursachen bei Patienten ist, die einen ischämischen Schlaganfall erlitten haben. Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Verwendung der mehrfarbigen Durchflusszytometrie zu beschreiben, um 13 Arten von Immunzellen in der Lunge von Mäusen zu identifizieren, einschließlich alveolärer Makrophagen, interstitieller Makrophagen, CD103+ oder CD11b + dendritische Zellen (DCs), plasmazytoide DCs, Eosinophile, Monozyten / Monozyten-abgeleitete Zellen, Neutrophile, lymphoide T- und B-Zellen, NK-Zellen und NKT-Zellen, nach ischämischer Schlaganfallinduktion durch vorübergehenden mittleren Hirnarterienverschluss. Darüber hinaus beschreiben wir die Herstellung von Lungenhomogenaten unter Verwendung einer Perlenhomogenisierungsmethode, um die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen gleichzeitig durch Multiplex-Bead-Arrays gekoppelt mit durchflusszytometrischer Analyse zu bestimmen. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um die pulmonale Immunantwort in anderen Krankheitssituationen wie infektiösen Lungenerkrankungen oder allergischen Erkrankungen zu untersuchen.
Introduction
Die Lunge ist ein Barriereorgan, das der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und daher ständig immunologischen Herausforderungen wie Krankheitserregern und Allergenen ausgesetzt ist1. Die Aktivierung lungenresidenter Immunzellen und die Infiltration von Immunzellen aus der Peripherie sind erforderlich, um Krankheitserreger aus der pulmonalen Umgebung zu entfernen. Darüber hinaus halten lungenresidente Immunzellen die Toleranz gegenüber kommensalen Bakterien aufrecht, was darauf hindeutet, dass diese Zellen eine Rolle bei der Pathogenentfernung und der Aufrechterhaltung der Homöostase spielen1. Alveoläre und interstitielle Makrophagen gehören zu den lungenresidenten Sentinel-Immunzellen, die Krankheitserreger über Mustererkennungsrezeptoren wahrnehmen und durch Phagozytosebeseitigen 2. Lungenansässige dendritische Zellen überbrücken die angeborene und adaptive Immunantwort durch Antigenpräsentation3. Darüber hinaus produzieren aktivierte lokale angeborene Immunzellen Zytokine und Chemokine, die die Entzündungsreaktion verstärken und die Infiltration von Immunzellen wie Monozyten, Neutrophilen und Lymphozyten in die Lunge stimulieren1. Es wurde gezeigt, dass ein ischämischer Schlaganfall die systemische Immunität verändert und zu einer erhöhten Anfälligkeit für Lungeninfektionen führt. Allerdings haben nur wenige Studien das Lungenkompartiment nach einem ischämischen Schlaganfall untersucht, obwohl einige Studien es bei entzündlichen Zuständenuntersucht haben 4,5,6,7,8,9. Das Ziel der hierin beschriebenen Verfahren ist es, gleichzeitig die Lungenpathologie, die Immunzellzusammensetzung und die Zytokin- und Chemokinexpression in der Lunge zu bestimmen, um Veränderungen am Lungenkompartiment zu bewerten und mögliche Veränderungen der pulmonalen Immunantwort nach einer ischämischen Attacke zu bewerten.
Hier wird ein Protokoll zur Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus den Lungen der Mäuse beschrieben, um 13 Arten von Immunzellen zu identifizieren. Dieses Protokoll basiert auf der Gewebeverdauung mit Kollagenase D, ohne dass ein automatisierter Gewebedissoziator erforderlich ist. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll zur Herstellung von Gewebehomogenaten entwickelt, mit dem die Expressionsniveaus von 13 verschiedenen Zytokinen oder Chemokinen mithilfe von Durchflusszytometrie-basierten Multiplex-Bead-Arrays bestimmt werden können. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um die Auswirkungen eines ischämischen Schlaganfalls auf die pulmonale Immunität zu untersuchen und kann auch in anderen Krankheitsmodellen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Protokolle ermöglichen die Identifizierung von Lungenimmunzelltypen und die Expression von Chemokinen oder Zytokinen in derselben Maus. Wenn eine histopathologische Untersuchung gewünscht wird, kann ein einzelner Lappen zu diesem Zweck entfernt und fixiert werden, bevor mit den Einzelzellisolierungsschritten fortgefahren wird. Eine Einschränkung dieser Methode besteht darin, dass dieser Ansatz in einigen Krankheitssituationen möglicherweise nicht geeignet ist, wenn die Veränderung der Immunzel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss P20 GM109098 und das Innovation Award Program von Praespero an Edwin Wan unterstützt. Durchflusszytometrie-Experimente wurden in der WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility durchgeführt, die durch die NIH-Zuschüsse S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 und P20 GM103434 unterstützt wird.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
Referências
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