Caracterização de Células Imunes e Mediadores Proinflamatórios no Ambiente Pulmonar
Summary
Este protocolo descreve o uso de citometria de fluxo para identificar as alterações na composição das células imunes, perfil de citocina e perfil de quimiocina no ambiente pulmonar após a oclusão da artéria cerebral média transitória, um modelo murino de derrame isquêmico.
Abstract
A expansão, ativação e tráfico de células imunes aos pulmões, que são controladas pela expressão de múltiplas citocinas e quimiocinas, podem ser alteradas por lesões cerebrais graves. Isso é evidenciado pelo fato de que a pneumonia é uma das principais causas de mortalidade em pacientes que sofreram de AVC isquêmico. O objetivo deste protocolo é descrever o uso de análises citométricas de fluxo multicolorido para identificar 13 tipos de células imunes nos pulmões de camundongos, incluindo macrófagos alveolares, macrófagos intersticiciais, células dendríticas CD103+ ou CD11b+ (DCs), DCs plasmacitoides, eosinófilos, monocitos/células derivadas de monocitos, neutrófilos, células T e B derivadas de linfoides, células NK e NKT, após indução de derrame isquêmico por oclusão de artéria cerebral média transitória. Além disso, descrevemos a preparação de homogeneizadores pulmonares utilizando um método de homogeneização de contas, para determinar os níveis de expressão de 13 citocinas diferentes ou quimiocinas simultaneamente por matrizes multiplex de contas acopladas à análise citométrica de fluxo. Este protocolo também pode ser usado para investigar a resposta imune pulmonar em outros ambientes da doença, como doença pulmonar infecciosa ou doença alérgica.
Introduction
Os pulmões são um órgão de barreira, exposto ao ambiente externo e, portanto, estão constantemente recebendo desafios imunológicos, como patógenos e alérgenos1. A ativação de células imunes residentes no pulmão e a infiltração de células imunes da periferia são necessárias para limpar patógenos do ambiente pulmonar. Além disso, as células imunes residentes no pulmão mantêm a tolerância às bactérias commensais, sugerindo que essas células desempenham um papel no desembaraço do patógeno e na manutenção da homeostase1. Macrófagos alveolares e intersticiais estão entre as células imunes sentinelas residentes no pulmão que sentem patógenos através de receptores de reconhecimento de padrões e limpam esses patógenos por fagocitose2. Células dendríticas residentes no pulmão conectam a resposta imune inata e adaptativa através da apresentação de antígeno3. Além disso, células imunes inatas locais ativadas produzem citocinas e quimioterapias que amplificam a resposta inflamatória e estimulam a infiltração de células imunes como monócitos, neutrófilos e linfócitos nos pulmões1. O AVC isquêmico mostrou-se modificar a imunidade sistêmica e levar ao aumento da suscetibilidade à infecção pulmonar; no entanto, poucos estudos avaliaram o compartimento pulmonar após o acidente vascular cerebral isquêmico, embora alguns estudos o tenham examinado durante as condições inflamatórias 4,5,6,7,8,9. O objetivo dos métodos descritos aqui é determinar simultaneamente a patologia pulmonar, a composição das células imunes e os níveis de citocina e expressão de quimiocina nos pulmões para avaliar alterações no compartimento pulmonar e avaliar possíveis alterações na resposta imune pulmonar após ataque isquêmico.
Descrito aqui é um protocolo para obter suspensões de células únicas dos pulmões dos camundongos para identificar 13 tipos de células imunes. Este protocolo é baseado na digestão tecidual com colagemnase D sem a necessidade de um dissociador de tecido automatizado. Além disso, desenvolvemos um protocolo para preparar homogeneizadores teciduais que podem ser usados para determinar os níveis de expressão de 13 citocinas diferentes ou quimiocinas usando matrizes de contas multiplex baseadas em cytometria de fluxo. Este protocolo foi usado com sucesso para investigar os efeitos do derrame isquêmico na imunidade pulmonar e também pode ser usado em outros modelos de doenças.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos aqui descritos permitem a identificação de tipos de células imunes pulmonares e a expressão de quimiocinas ou citocinas no mesmo rato. Se um estudo de histopatologia for desejado, um lobo individual pode ser removido e fixado para esse fim antes de prosseguir para as etapas de isolamento de célula única. Uma limitação deste método é que essa abordagem pode não ser adequada em alguns cenários da doença se a mudança na composição das células imunes e a expressão de quimiocinas e/ou citocinas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH P20 GM109098 e pelo Programa de Prêmio de Inovação da Praespero a Edwin Wan. Os experimentos de Citometria de Fluxo foram realizados no WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility, que é suportado pelas bolsas NIH S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 e P20 GM103434.
Materials
| B220-APC, clone RA3-6B2 | Biolegend | 103212 | 1:200 dilution |
| Beadbug 3 position bead homogenizer | Benchmark Scientific | D1030 | Tissue homogenizer |
| CCR2-BV421, clone SA203G11 | Biolegend | 150605 | 1:200 dilution |
| CD103-BV421, clone 2E7 | Biolegend | 121422 | 1:200 dilution |
| CD11b-PE/Cy7, clone M1/70 | Biolegend | 101216 | 1:400 dilution |
| CD11c-PE/Cy7, clone N418 | Biolegend | 117318 | 1:200 dilution |
| CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418 | Biolegend | 117328 | 1:200 dilution |
| CD4-BV421, clone GK1.5 | Biolegend | 100443 | 1:200 dilution |
| CD45-FITC, clone 30-F11 | Biolegend | 103108 | 1:200 dilution |
| CD64-APC, clone X54-5/7.1 | Biolegend | 139306 | 1:200 dilution |
| CD8-PE, clone 53-6.7 | Biolegend | 100708 | 1:800 dilution |
| Collagenase D | Sigma Aldrich | 11088882001 | Component in the dissociation buffer |
| Conical screw cap tube | ThermoFisher | 02-681-344 | Tube for tissue homogenization |
| DNase I | Sigma Aldrich | 10104159001 | Component in the dissociation buffer |
| Fc block CD16/32 antibody | Biolegend | 101320 | 1:100 dilution |
| genlteMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator |
| gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator |
| Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial | ThermoFisher | 78442 | Component in the homogenization buffer |
| Laser doppler monitor | Moor | MOORVMS-LDF | Blood flow monitoring during tMCAO |
| LEGENDplex proinflammatory chemokine panel | Biolegend | 740451 | Multiplex bead array |
| LIVE/DEAD fixable near-IR stain | ThermoFisher | L34976 | Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis |
| Ly6C-PE, clone HK1.4 | Biolegend | 128008 | 1:800 dilution |
| Ly6G-BV510, clone 1A8 | Biolegend | 127633 | 1:200 dilution |
| MCAO suture L56 reusable 6-0 medium | Doccol | 602356PK10Re | tMCAO |
| MHC II-BV510, clone M5/114.15.2 | Biolegend | 107636 | 1:800 dilution |
| NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136 | Biolegend | 108728 | 1:200 dilution |
| Siglec F-PE, clone E50-2440 | BD Biosciences | 552126 | 1:200 dilution |
| Silk suture thread, size 6/0 | Fine Science Tools | 18020-60 | tMCAO |
| SomnoSuite anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Mouse anaesthetization for tMCAO |
| TCRb-BV510, clone H57-897 | Biolegend | 109234 | 1:200 dilution |
| Zirconia/silica beads, 2.3 mm | Biospec | 11079125z | Beads for tissue homogenization |
Referências
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