集束走査超音波を用いた脳への抗体の送達
Summary
ここでは、血液脳関門(BBB)を葉状またはマウス脳全体に一過性に開放して蛍光標識抗体を送達し、ミクログリアを活性化するプロトコルを紹介します。また、組織学による抗体の送達およびミクログリア活性化を検出する方法も提示される。
Abstract
脳疾患を標的とする抗体医薬のごく一部のみが脳に取り込まれます。集束超音波は、血液脳関門(BBB)の一時的な開放を介して抗体の取り込みおよび関与を増加させる可能性を提供する。当研究室では、複数の部位を標的とした頭蓋骨を標的とした集束超音波の適用と併せて、マイクロバブルを用いてBBB全体に様々な形態の抗体を送達する神経変性疾患の治療アプローチを開発しています。血管に対するマイクロバブルおよび超音波の機械的効果は、タイトジャンクションを一時的に分離することによってBBBを横切る傍細胞輸送を増加させ、小胞媒介性トランスサイトーシスを増強し、抗体および治療剤が効果的に交差することを可能にする。さらに、超音波はまた、抗体が細胞体全体に分布するニューロンなどの脳細胞への間質脳からの抗体の取り込みを容易にし、さらには神経炎プロセスにも促進する。本研究では、蛍光標識抗体を調製し、自社で調製した脂質ベースのマイクロバブルと混合し、SUSを脳に塗布する直前にマウスに注射します。その後、脳内の抗体濃度の増加が定量化されます。正常な脳恒常性の変化を説明するために、ミクログリア貪食作用を細胞マーカーとして使用することができる。生成されたデータは、抗体の超音波送達が神経変性疾患を治療するための魅力的なアプローチであることを示唆している。
Introduction
治療用超音波は、脳への治療薬のアクセスを容易にすることによって、非侵襲的な方法で脳疾患を治療することを目的とした新興技術です1,2,3。脳疾患を標的とする治療用抗体のごく一部のみが脳に取り込まれ、脳内に保持されるため4、治療用超音波は、その取り込みと標的エンゲージメントを高める可能性を提供します5,6。
当研究室では、マイクロバブルを用いて血液脳関門(BBB)を介して様々な形態の抗体を送達する神経変性疾患の治療アプローチを開発しています。これを達成するために、超音波は、我々が走査超音波(SUS)7と呼ぶ走査モードを使用して、頭蓋骨を通って脳に複数のスポットで適用される。超音波エネルギー、静脈内注入されたマイクロバブルおよび脳血管系との間の機械的相互作用は、所与の超音波処理体積におけるBBBのタイトジャンクションを一過性に分離し、抗体および治療薬を含む他の貨物がこの障壁を効果的に通過することを可能にする7,8,9.さらに、超音波は、間質性脳からニューロンなどの脳細胞への抗体の取り込みを容易にし、抗体が細胞体全体および神経炎プロセスにさえ分布することが示されている5,10。
アルツハイマー病はアミロイドβとタウの病理11によって特徴付けられ、病原性メカニズムを解剖し、治療戦略を検証するために多数の動物モデルが利用可能です。超音波を脳全体に逐次パターンで適用するSUSアプローチを数回の治療セッションにわたって繰り返すと、アミロイドβ沈着アミロイド前駆体タンパク質(APP)変異マウスの脳内のアミロイドプラーク病理を軽減し、アミロイドを取り込むミクログリアを活性化し、認知機能の改善につながります7。超音波およびマイクロバブルによるBBB開口部はまた、pR5、K3およびrTg4510タウトランスジェニックマウスにおけるタウ病理を減少させる5,12,13。重要なことに、ミクログリアは細胞外タンパク質沈着物を除去するが、SUSによって誘導されるニューロン内病理の根底にあるクリアランスメカニズムの1つは、ニューロンオートファジーの活性化である12。
ここでは、蛍光標識抗体を調製し、社内の脂質ベースのマイクロバブルと混合した後、麻酔をかけたマウスに眼窩後注射する実験プロセスを概説する。眼窩後注射は尾静脈注射の代替であり、同様に効果的で繰り返し行う方が簡単であることがわかっています。これに続いて、SUSを脳に適用します。治療用抗体の取り込みを決定するために、マウスを屠殺し、脳内の増加した抗体濃度を定量化する。脳恒常性の変化の代理として、ミクログリア貪食活性は、組織学および体積3D再構成によって決定される。
生成されたデータは、抗体の超音波送達が神経変性疾患を治療するための潜在的に魅力的なアプローチであることを示唆している。このプロトコルは、他の医薬品候補や、定義されたサイズの蛍光標識されたデキストランなどのモデル貨物にも同様に適用できます14。
Protocol
Representative Results
Discussion
蛍光標識抗体は、走査モードで適用されるマイクロバブルと共に集束超音波を使用して脳に送達することができる。抗体送達、ミクログリア形態およびリソソーム拡大は、走査型超音波に続く蛍光顕微鏡によって検出することができる。ミクログリアは、Fc受容体媒介プロセスにおいて抗体と抗体が結合した抗原をリソソームに取り込むことができます4。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、クレム・ジョーンズAO博士のエステート、オーストラリア国立保健医療研究評議会[GNT1145580、GNT1176326]、金属財団、クイーンズランド州政府(DSITI、科学・情報技術・イノベーション省)の支援を認める。
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
Referências
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