使用聚焦扫描超声将抗体输送到大脑中
Summary
这里介绍的是一种方案，用于局部或整个小鼠大脑短暂打开血脑屏障（BBB），以传递荧光标记的抗体并激活小胶质细胞。还提出了一种通过组织学检测抗体递送和小胶质细胞活化的方法。
Abstract
只有一小部分针对脑部疾病的治疗性抗体被大脑吸收。聚焦超声提供了通过血脑屏障（BBB）的短暂打开来增加抗体摄取和参与的可能性。在我们的实验室中，我们正在开发神经退行性疾病的治疗方法，其中使用微气泡将各种形式的抗体输送到BBB中，同时通过针对多个点的颅骨进行聚焦超声应用，我们称之为扫描超声（SUS）。微气泡和超声对血管的机械效应通过瞬时分离紧密连接来增加BBB的细胞旁转运，并增强囊泡介导的转运，使抗体和治疗剂能够有效地交叉。此外，超声还有助于将抗体从间质大脑摄取到脑细胞中，例如抗体分布在整个细胞体中的神经元，甚至进入神经炎过程。在我们的研究中，制备荧光标记的抗体，与内部制备的基于脂质的微气泡混合，并在SUS应用于大脑之前立即注射到小鼠中。然后量化大脑中增加的抗体浓度。为了解释正常脑稳态的改变，小胶质细胞吞噬作用可用作细胞标志物。产生的数据表明，抗体的超声递送是治疗神经退行性疾病的一种有吸引力的方法。
Introduction
治疗性超声是一种新兴技术，旨在以非侵入性方式治疗脑部疾病，部分原因是通过促进治疗剂进入大脑1，2，3。由于只有一小部分针对脑部疾病的治疗性抗体被大脑吸收并保留在大脑中4，因此治疗性超声提供了增加其摄取和靶向参与的可能性5，6。
在我们的实验室中，我们正在开发神经退行性疾病的治疗方法，其中各种形式的抗体使用微气泡通过血脑屏障（BBB）递送。为了实现这一点，超声波通过颅骨施加到大脑的多个位置，使用我们称之为扫描超声波（SUS）7的扫描模式。超声能量、静脉注射微气泡和脑脉管系统之间的机械相互作用在给定的超声处理体积中瞬时分离BBB的紧密连接，允许抗体和包括治疗剂在内的其他货物有效地穿过这一屏障7，8，9.此外，超声已被证明可以促进抗体从间质性大脑摄取到脑细胞中，例如神经元，其中抗体分布在整个细胞体中，甚至进入神经炎过程5，10。
阿尔茨海默病的特征是淀粉样蛋白β和tau病理学11，并且可以使用许多动物模型来剖析致病机制并验证治疗策略。SUS方法，通过这种方法，超声波以顺序模式应用于整个大脑，当在几个治疗过程中重复时，可以减少淀粉样蛋白β沉积淀粉样蛋白前体蛋白（APP）突变小鼠大脑中的淀粉样蛋白斑块病理学，并激活占据淀粉样蛋白的小胶质细胞，从而改善认知功能7。用超声和微气泡打开BBB也会降低pR5，K3和rTg4510 tau转基因小鼠的tau病理学5，12，13。重要的是，虽然小胶质细胞去除细胞外蛋白沉积物，但SUS诱导的神经间病变的潜在清除机制之一是神经元自噬的激活12。
在这里，我们概述了一个实验过程，通过该过程制备荧光标记的抗体，然后与内部基于脂质的微泡混合，然后向麻醉小鼠进行逆眶注射。眶后注射是尾静脉注射的替代方案，我们发现尾静脉注射同样有效且易于重复执行。紧随其后的是将SUS应用于大脑。为了确定治疗性抗体摄取，处死小鼠，然后量化大脑中增加的抗体浓度。作为脑稳态变化的代表，小胶质细胞吞噬活性通过组织学和体积3D重建确定。
产生的数据表明，抗体的超声递送是治疗神经退行性疾病的潜在有吸引力的方法。该协议可以类似地应用于其他候选药物，以及模型货物，例如定义大小的荧光标记葡聚糖14。
Protocol
Representative Results
Discussion
荧光标记的抗体可以使用聚焦超声和扫描模式下施加的微气泡一起传递到大脑。抗体递送、小胶质细胞形态和溶酶体肿大可通过超声扫描后的荧光显微镜检测。小胶质细胞可以吸收到其溶酶体抗体和抗原中，抗体在Fc受体介导的过程中结合4。
使用这种方法实现可重复的BBB开放和抗体递送有许多关键步骤。确保超声换能器和鼠标头部之间的良好耦合至关重要?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Clem Jones AO博士的遗产，澳大利亚国家卫生和医学研究委员会[GNT1145580，GNT1176326]，金属基金会和昆士兰州政府（DSITI，科学，信息技术和创新部）的支持。
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
Referências
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