केंद्रित स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड का उपयोग कर मस्तिष्क में एंटीबॉडी का वितरण
Summary
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) को क्षणिक रूप से खोलने के लिए या तो फोकल रूप से या माउस मस्तिष्क में फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी वितरित करने और माइक्रोग्लिया को सक्रिय करने के लिए है। इसके अलावा प्रस्तुत एंटीबॉडी और histology द्वारा microglia सक्रियण के वितरण का पता लगाने के लिए एक विधि है.
Abstract
मस्तिष्क रोगों को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एंटीबॉडी का केवल एक छोटा सा अंश मस्तिष्क द्वारा लिया जाता है। केंद्रित अल्ट्रासाउंड रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) के क्षणिक उद्घाटन के माध्यम से एंटीबॉडी और सगाई के उत्थान को बढ़ाने की संभावना प्रदान करता है। हमारी प्रयोगशाला में, हम न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित कर रहे हैं जिसमें विभिन्न प्रारूपों में एक एंटीबॉडी को बीबीबी में माइक्रोबबल्स का उपयोग करके वितरित किया जाता है, खोपड़ी के माध्यम से केंद्रित अल्ट्रासाउंड एप्लिकेशन के साथ सहवर्ती कई धब्बों को लक्षित करता है, एक दृष्टिकोण जिसे हम स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड (एसयूएस) के रूप में संदर्भित करते हैं। रक्त वाहिकाओं पर माइक्रोबबल्स और अल्ट्रासाउंड के यांत्रिक प्रभाव ों से बीबीबी में परकोशिकीय परिवहन को क्षणिक रूप से तंग जंक्शनों को अलग करके बढ़ा दिया जाता है और पुटिका-मध्यस्थता ट्रांससाइटोसिस को बढ़ाता है, जिससे एंटीबॉडी और चिकित्सीय एजेंटों को प्रभावी ढंग से पार करने की अनुमति मिलती है। इसके अलावा, अल्ट्रासाउंड भी अंतरालीय मस्तिष्क से मस्तिष्क कोशिकाओं जैसे न्यूरॉन्स में एंटीबॉडी के उत्थान की सुविधा प्रदान करता है जहां एंटीबॉडी पूरे सेल शरीर में और यहां तक कि न्यूरिटिक प्रक्रियाओं में भी वितरित होता है। हमारे अध्ययनों में, फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी तैयार किए जाते हैं, इन-हाउस तैयार लिपिड-आधारित माइक्रोबबल्स के साथ मिश्रित होते हैं और एसयूएस को मस्तिष्क पर लागू करने से तुरंत पहले चूहों में इंजेक्ट किया जाता है। मस्तिष्क में बढ़ी हुई एंटीबॉडी एकाग्रता को तब परिमाणित किया जाता है। सामान्य मस्तिष्क होमोस्टैसिस में परिवर्तन के लिए खाते के लिए, माइक्रोग्लियल फागोसाइटोसिस का उपयोग सेलुलर मार्कर के रूप में किया जा सकता है। उत्पन्न डेटा से पता चलता है कि एंटीबॉडी का अल्ट्रासाउंड वितरण न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण है।
Introduction
चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड एक उभरती हुई तकनीक है जिसका उद्देश्य मस्तिष्क की बीमारियों का इलाज एक noninvasive तरीके से करना है, भाग में मस्तिष्क 1,2,3 के लिए चिकित्सीय एजेंटों की पहुंच की सुविधा प्रदान करके। जैसा कि मस्तिष्क की बीमारियों को लक्षित करने वाले चिकित्सीय एंटीबॉडी का केवल एक छोटा सा अंश मस्तिष्क 4 में लिया जाता है और बनाए रखा जाता है, चिकित्सीय अल्ट्रासाउंड उनके उत्थान और लक्ष्य सगाई को बढ़ाने की संभावना प्रदान करता है5,6।
हमारी प्रयोगशाला में, हम न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के लिए चिकित्सीय दृष्टिकोण विकसित कर रहे हैं जिसमें विभिन्न प्रारूपों में एक एंटीबॉडी माइक्रोबबल्स का उपयोग करके रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) में वितरित की जाती है। इसे प्राप्त करने के लिए, अल्ट्रासाउंड को एक स्कैनिंग मोड का उपयोग करके कई स्थानों में मस्तिष्क में खोपड़ी के माध्यम से लागू किया जाता है जिसे हम स्कैनिंग अल्ट्रासाउंड (एसयूएस) 7 के रूप में संदर्भित करते हैं। अल्ट्रासाउंड ऊर्जा के बीच यांत्रिक बातचीत, अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किए गए माइक्रोबबल्स और मस्तिष्क वास्कुलचर क्षणिक रूप से किसी दिए गए sonication मात्रा में BBB के तंग जंक्शनों को अलग करता है, जिससे एंटीबॉडी और चिकित्सीय एजेंटों सहित अन्य कार्गो को प्रभावी ढंग से इस बाधा को पार करने की अनुमति मिलती है7,8,9 . इसके अलावा, अल्ट्रासाउंड को अंतरालीय मस्तिष्क से मस्तिष्क कोशिकाओं में एंटीबॉडी के उत्थान की सुविधा के लिए दिखाया गया है, जैसे कि न्यूरॉन्स, जहां एंटीबॉडी पूरे सेल शरीर में और यहां तक कि न्यूरिटिक प्रक्रियाओं में भी वितरित होता है5,10।
अल्जाइमर रोग एक एमाइलॉइड-β और ताऊ पैथोलॉजी 11 की विशेषता है, और रोगजनक तंत्र को विच्छेदित करने और चिकित्सीय रणनीतियों को मान्य करने के लिए पशु मॉडल का एक मेजबान उपलब्ध है। एक एसयूएस दृष्टिकोण, जिसके द्वारा अल्ट्रासाउंड को पूरे मस्तिष्क में एक अनुक्रमिक पैटर्न में लागू किया जाता है, जब कई उपचार सत्रों में दोहराया जाता है, तो अमाइलॉइड-β-जमा करने वाले एमिलॉइड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) उत्परिवर्ती चूहों के दिमाग में अमाइलॉइड पट्टिका विकृति को कम कर सकता है और माइक्रोग्लिया को सक्रिय कर सकता है जो अमाइलॉइड लेता है, जिससे संज्ञानात्मक कार्य में सुधार होता है। अल्ट्रासाउंड और microbubbles के साथ BBB खोलने भी pR5, K3 और rTg4510 ताऊ ट्रांसजेनिक mice5,12,13 में ताऊ विकृति को कम कर देता है। महत्वपूर्ण रूप से, जबकि माइक्रोग्लिया बाह्य कोशिकीय प्रोटीन जमा को हटा देता है, एसयूएस द्वारा प्रेरित इंट्रान्यूरॉनल पैथोलॉजी के लिए अंतर्निहित निकासी तंत्र में से एक न्यूरोनल ऑटोफैगी 12 का सक्रियण है।
यहां, हम एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया की रूपरेखा तैयार करते हैं, जिसके द्वारा फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी तैयार किए जाते हैं, और फिर इन-हाउस लिपिड-आधारित माइक्रोबबल्स के साथ मिश्रित होते हैं, जिसके बाद एनेस्थेटिक चूहों में रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन होता है। रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन पूंछ शिरा इंजेक्शन का एक विकल्प है जिसे हमने बार-बार प्रदर्शन करने के लिए समान रूप से प्रभावी और सरल पाया है। इसके तुरंत बाद मस्तिष्क में एसयूएस लागू किया जाता है। चिकित्सीय एंटीबॉडी अपटेक को निर्धारित करने के लिए, चूहों की बलि दी जाती है और मस्तिष्क में बढ़ी हुई एंटीबॉडी एकाग्रता को तब परिमाणित किया जाता है। मस्तिष्क होमोस्टैसिस में परिवर्तन के प्रॉक्सी के रूप में, माइक्रोग्लियल फागोसाइटिक गतिविधि हिस्टोलॉजी और वॉल्यूमेट्रिक 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा निर्धारित की जाती है।
उत्पन्न डेटा से पता चलता है कि एंटीबॉडी का अल्ट्रासाउंड वितरण न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों के इलाज के लिए एक संभावित आकर्षक दृष्टिकोण है। प्रोटोकॉल को इसी तरह अन्य दवा उम्मीदवारों के लिए लागू किया जा सकता है, साथ ही मॉडल कार्गो जैसे कि फ्लोरोसेंटली लेबल किए गए डेक्सट्रांस परिभाषित आकार14।
Protocol
Representative Results
Discussion
फ्लोरोसेंटली-लेबल एंटीबॉडी को स्कैनिंग मोड में लागू माइक्रोबबल्स के साथ केंद्रित अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके मस्तिष्क में वितरित किया जा सकता है। एंटीबॉडी वितरण, माइक्रोग्लियल आकृति विज्ञान और लाइ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ क्लेम जोन्स एओ, ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद [GNT1145580, GNT1176326], मेटल फाउंडेशन, और क्वींसलैंड की राज्य सरकार (DSITI, विज्ञान, सूचना प्रौद्योगिकी और नवाचार विभाग) की संपत्ति द्वारा समर्थन स्वीकार करते हैं।
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
Referências
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