Consegna di anticorpi nel cervello utilizzando ultrasuoni a scansione focalizzata
Summary
Qui viene presentato un protocollo per aprire transitoriamente la barriera emato-encefalica (BBB) sia focalmente che attraverso un cervello di topo per fornire anticorpi marcati fluorescentemente e attivare la microglia. Viene inoltre presentato un metodo per rilevare la somministrazione di anticorpi e l’attivazione della microglia mediante istologia.
Abstract
Solo una piccola frazione degli anticorpi terapeutici che colpiscono le malattie del cervello sono assorbiti dal cervello. L’ecografia focalizzata offre la possibilità di aumentare l’assorbimento di anticorpi e l’impegno attraverso l’apertura transitoria della barriera emato-encefalica (BBB). Nel nostro laboratorio, stiamo sviluppando approcci terapeutici per le malattie neurodegenerative in cui un anticorpo in vari formati viene consegnato attraverso la BBB utilizzando microbolle, in concomitanza con l’applicazione di ultrasuoni focalizzati attraverso il cranio mirando a più punti, un approccio a cui ci riferiamo come ecografia a scansione (SUS). Gli effetti meccanici delle microbolle e degli ultrasuoni sui vasi sanguigni aumentano il trasporto paracellulare attraverso la BBB separando transitoriamente le giunzioni strette e migliorano la transcitosi mediata dalle vescicole, consentendo agli anticorpi e agli agenti terapeutici di attraversarsi efficacemente. Inoltre, gli ultrasuoni facilitano anche l’assorbimento di anticorpi dal cervello interstiziale in cellule cerebrali come i neuroni in cui l’anticorpo si distribuisce in tutto il corpo cellulare e persino nei processi neuritici. Nei nostri studi, vengono preparati anticorpi marcati con fluorescenza, mescolati con microbolle a base lipidica preparate internamente e iniettati nei topi immediatamente prima che la SUS venga applicata al cervello. L’aumento della concentrazione di anticorpi nel cervello viene quindi quantificato. Per tenere conto delle alterazioni nella normale omeostasi cerebrale, la fagocitosi microgliale può essere utilizzata come marcatore cellulare. I dati generati suggeriscono che la somministrazione di ultrasuoni di anticorpi è un approccio interessante per il trattamento delle malattie neurodegenerative.
Introduction
L’ecografia terapeutica è una tecnologia emergente volta a trattare le malattie del cervello in modo non invasivo, in parte facilitando l’accesso di agenti terapeutici al cervello1,2,3. Poiché solo una piccola frazione degli anticorpi terapeutici che prendono di mira le malattie cerebrali viene assorbita e trattenuta nel cervello4, gli ultrasuoni terapeutici offrono la possibilità di aumentarne l’assorbimento e l’impegno target5,6.
Nel nostro laboratorio, stiamo sviluppando approcci terapeutici per le malattie neurodegenerative in cui un anticorpo in vari formati viene consegnato attraverso la barriera emato-encefalica (BBB) utilizzando microbolle. Per raggiungere questo obiettivo, gli ultrasuoni vengono applicati attraverso il cranio nel cervello in più punti utilizzando una modalità di scansione a cui ci riferiamo come ultrasuoni di scansione (SUS)7. L’interazione meccanica tra l’energia ultrasonica, le microbolle iniettate per via endovenosa e la vascolarizzazione cerebrale separa transitoriamente le giunzioni strette della BBB in un dato volume di sonicazione, consentendo agli anticorpi e ad altri carichi, compresi gli agenti terapeutici, di attraversare efficacemente questa barriera7,8,9 . Inoltre, gli ultrasuoni hanno dimostrato di facilitare l’assorbimento di anticorpi dal cervello interstiziale nelle cellule cerebrali, come i neuroni, dove l’anticorpo si distribuisce in tutto il corpo cellulare e persino nei processi neuritici5,10.
La malattia di Alzheimer è caratterizzata da una patologia amiloide-β e tau11 e una serie di modelli animali è disponibile per sezionare meccanismi patogenetici e convalidare strategie terapeutiche. Un approccio SUS, con il quale gli ultrasuoni vengono applicati in un modello sequenziale su tutto il cervello, se ripetuti in diverse sessioni di trattamento, possono ridurre la patologia della placca amiloide nel cervello dei topi mutanti della proteina precursore dell’amiloide-β-depositante l’amiloide (APP) e attivare microglia che assorbono l’amiloide, portando a un miglioramento della funzione cognitiva7. L’apertura BBB con ultrasuoni e microbolle riduce anche la patologia tau nei topi transgenici tau pR5, K3 e rTg4510 tau5,12,13. È importante sottolineare che, mentre la microglia rimuove i depositi proteici extracellulari, uno dei meccanismi di clearance alla base delle patologie intraneuronali indotte dalla SUS è l’attivazione dell’autofagia neuronale12.
Qui, delineiamo un processo sperimentale, mediante il quale vengono preparati anticorpi marcati fluorescentemente e quindi miscelati con microbolle a base lipidica interne, seguite da iniezione retroorbitale in topi anestetizzati. L’iniezione retroorbitale è un’alternativa all’iniezione della vena della coda che abbiamo trovato ugualmente efficace e più semplice da eseguire ripetutamente. Questo è immediatamente seguito dall’applicazione di SUS al cervello. Per determinare l’assorbimento terapeutico degli anticorpi, i topi vengono sacrificati e l’aumento della concentrazione di anticorpi nel cervello viene quindi quantificato. Come proxy del cambiamento nell’omeostasi cerebrale, l’attività fagocitica microgliale è determinata dall’istologia e dalla ricostruzione volumetrica 3D.
I dati generati suggeriscono che la somministrazione di ultrasuoni di anticorpi è un approccio potenzialmente attraente per il trattamento delle malattie neurodegenerative. Il protocollo può essere applicato in modo simile ad altri farmaci candidati, nonché a carichi modello come dextrans etichettati fluorescentemente di dimensioni definite14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli anticorpi marcati con fluorescenza possono essere consegnati al cervello utilizzando ultrasuoni focalizzati insieme a microbolle applicate in modalità di scansione. La somministrazione di anticorpi, la morfologia microgliale e l’allargamento lisosomiale possono essere rilevati al microscopio a fluorescenza dopo l’ecografia a scansione. Le microglia possono assorbire nei loro lisosomi anticorpi e antigeni a cui gli anticorpi si sono legati in un processo mediato dal recettore Fc4.
<p class…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il sostegno della tenuta del Dr Clem Jones AO, del National Health and Medical Research Council of Australia [GNT1145580, GNT1176326], della Metal Foundation e del governo statale del Queensland (DSITI, Dipartimento di Scienza, Information Technology e Innovazione).
Materials
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[amino(polyethyleneglycol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 antibody | AbD Serotec | MCA1957GA | Use 1:1000 dilution |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Coulter Counter (Multisizer 4e) | |||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use 1:500 dilution |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use 1:500 dilution |
| head holder (model SG-4N, Narishige Japan) | |||
| Iba1 antibody | Wako | 019-19741 | Use 1:1000 dilution |
| Image analysis software | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Isoflow flow solution | Beckman Coulter | B43905 | |
| Near infrared imaging system Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropane | Arcadophta | 0229NC | |
| Propylene Glycol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Therapy Imaging Probe System) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
Referências
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer’s double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al. Blood-brain barrier opening in Alzheimer’s disease using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 9 (1), 2336 (2018).
- Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. (19), 30238 (2019).
- Golde, T. E. Open questions for Alzheimer’s disease immunotherapy. Alzheimers Research & Therapy. 6 (1), 3 (2014).
- Nisbet, R. M., et al. Combined effects of scanning ultrasound and a tau-specific single chain antibody in a tau transgenic mouse model. Brain. 140 (5), 1220-1230 (2017).
- Janowicz, P. W., Leinenga, G., Götz, J., Nisbet, R. M. Ultrasound-mediated blood-brain barrier opening enhances delivery of therapeutically relevant formats of a tau-specific antibody. Scientific Reports. 9 (1), 9255 (2019).
- Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-beta and restores memory in an Alzheimer’s disease mouse model. Science Translational Medicine. 7 (278), 233 (2015).
- Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877 (2011).
- Chen, H., et al. Focused ultrasound-enhanced intranasal brain delivery of brain-derived neurotrophic factor. Scientific Reports. 6, 28599 (2016).
- Leinenga, G., Langton, C., Nisbet, R., Götz, J. Ultrasound treatment of neurological diseases – current and emerging applications. Nature Reviews Neurology. 12 (3), 161-174 (2016).
- Götz, J., Halliday, G., Nisbet, R. M. Molecular Pathogenesis of the Tauopathies. Annual Reviews of Pathology. 14, 239-261 (2019).
- Pandit, R., Leinenga, G., Götz, J. Repeated ultrasound treatment of tau transgenic mice clears neuronal tau by autophagy and improves behavioral functions. Theranostics. 9 (13), 3754-3767 (2019).
- Karakatsani, M. E., et al. Unilateral Focused Ultrasound-Induced Blood-Brain Barrier Opening Reduces Phosphorylated Tau from The rTg4510 Mouse Model. Theranostics. 9 (18), 5396-5411 (2019).
- Valdez, M. A., Fernandez, E., Matsunaga, T., Erickson, R. P., Trouard, T. P. Distribution and Diffusion of Macromolecule Delivery to the Brain via Focused Ultrasound using Magnetic Resonance and Multispectral Fluorescence Imaging. Ultrasound in Medicine and Biology. 46 (1), 122-136 (2020).
