Apresentado aqui é um protocolo para abrir transitoriamente a barreira hematoencefálica (BBB) focalmente ou em todo o cérebro do rato para fornecer anticorpos fluorescentes e ativar microglia. Também é apresentado um método para detectar a entrega de anticorpos e ativação de microglia por histologia.
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Artigo de método
Entrega de anticorpos no cérebro usando ultrassom de varredura focalizado
Neste artigo
Resumo
Resumo
Apenas uma pequena fração de anticorpos terapêuticos voltados para doenças cerebrais são tomados pelo cérebro. O ultrassom focado oferece a possibilidade de aumentar a absorção de anticorpos e o engajamento através da abertura transitória da barreira hematoencefálica (BBB). Em nosso laboratório, estamos desenvolvendo abordagens terapêuticas para doenças neurodegenerativas em que um anticorpo em diversos formatos é entregue em todo o BBB utilizando microbolhas, concomitante com aplicação de ultrassom focalizada através do crânio visando múltiplas manchas, uma abordagem que chamamos de ultrassom de varredura (SUS). Os efeitos mecânicos de microbolhas e ultrassom nos vasos sanguíneos aumentam o transporte paracelular através do BBB, separando transitoriamente junções apertadas e aumentando a transcitose mediada por vesículas, permitindo que anticorpos e agentes terapêuticos cruzem efetivamente. Além disso, o ultrassom também facilita a absorção de anticorpos do cérebro intersticicial em células cerebrais, como neurônios onde o anticorpo se distribui por todo o corpo celular e até mesmo em processos neuróticos. Em nossos estudos, anticorpos fluorescentes rotulados são preparados, misturados com microbolhas baseadas em lipídios preparados internamente e injetados em camundongos imediatamente antes de o SUS ser aplicado ao cérebro. O aumento da concentração de anticorpos no cérebro é então quantificado. Para explicar alterações na homeostase cerebral normal, a fagocitose microglial pode ser usada como marcador celular. Os dados gerados sugerem que o fornecimento de ultrassom de anticorpos é uma abordagem atraente para tratar doenças neurodegenerativas.
Introdução
O ultrassom terapêutico é uma tecnologia emergente voltada para o tratamento de doenças cerebrais de forma não invasiva, em parte facilitando o acesso de agentes terapêuticos ao cérebro1,2,3. Como apenas uma pequena fração de anticorpos terapêuticos voltados para doenças cerebrais são absorvidos e retidos no cérebro4, o ultrassom terapêutico oferece a possibilidade de aumentar sua absorção e engajamento direcionado5,6.
Em nosso laboratório, estamos desenvolvendo abor....
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Protocolo
Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo comitê de ética animal da Universidade de Queensland.
1. Preparação interna de microbolhas
- Pese uma razão molar de 9:1 de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholina e 1,2-distearoyl-sn-gliceo-3-phosphoethanolamine-N-[amino (polietilenoglicol)-2000] (sal de amônio). 0,5 mg de mistura lipídica é necessário por 1 mL de solução de microbolhas. Alternativamente, os lipídios já podem ser comprados em clorofórmio, se o uso de lipídios pré-dissolvidos passar a passo 1.3.
- Dissolva o lipídio em um pequeno volume de clorofórmio em um copo de vidro.
- Evaporar o clorofórmio....
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Resultados
Usando este protocolo, anticorpos rotulados fluorescentemente são entregues ao cérebro e podem ser detectados, juntamente com a ativação de microglia. A conclusão que pode ser traçada é o uso de ultrassom focado e microbolhas marcadamente melhora a absorção cerebral de anticorpos e pode entregar anticorpos para todo o cérebro ou hemisfério de um rato quando usado em um modo de varredura. A Figura 1 mostra o dispositivo de aplicação de ultrassom TIPS (diferentes componentes rotulados) que é u.......
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Discussão
Anticorpos fluorescentes podem ser entregues ao cérebro usando ultrassom focado juntamente com microbolhas aplicadas em um modo de varredura. O parto de anticorpos, a morfologia microglial e o alargamento liossômico podem ser detectados por microscopia de fluorescência após o ultrassom de varredura. Microglia pode entrar em seus anticorpos e antígenos lysossomes que os anticorpos têm vinculado em um processo mediado por receptores fc4.
Há uma série de etapas críticas pa.......
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Divulgações
Não temos nada para revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos o apoio do Dr. Clem Jones AO, do Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica da Austrália [GNT1145580, GNT1176326], da Fundação metal, e do Governo do Estado de Queensland (DSITI, Departamento de Ciência, Tecnologia da Informação e Inovação).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina | Avanti | 850365C | |
| 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[amino(polietilenoglicol)-2000] | Avanti | 880128C | |
| AlexaFluor 647 kit de rotulagem | de anticorpos Thermo Fisher | A20186 | |
| CD68 anticorpo | AbD Serotec | MCA1957GA | Uso 1:1000 diluição |
| Contador de relha de clorofórmio | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| (Multisizer 4e) | |||
| Glicerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488 | Thermo FIsher | A-11008 | Use diluição 1:500 |
| IgG anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher | A-11077 | Use diluição |
| 1:500suporte de cabeça (modelo SG-4N, Narishige Japão) | |||
| Iba1 anticorpo | Wako | 019-19741 | Uso diluição 1:1000 |
| Software de análise de imagem | Beckman Coulter | #8547008 | |
| Solução de fluxo de isofluxo | Beckman Coulter | B43905 | |
| Sistema de imagem de infravermelho próximo Odyssey Fc | Licor | 2800-03 | |
| Octafluoropropano | Arcadophta | 0229NC | |
| Propilenoglicol | Sigma-Aldrich | P4347 | |
| TIPS (Sistema de Sonda de Imagem Terapêutica) | Philips Research | TIPS_007 | |
| Bitplane |
Referências
- Choi, J. J., et al. Noninvasive and transient blood-brain barrier opening in the hippocampus of Alzheimer's double transgenic mice using focused ultrasound. Ultrasonic Imaging. 30 (3), 189-200 (2008).
- Lipsman, N., et al.
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Reimpressões e permissões
