Descrito aqui é um método eficaz sobre como produzir altos estoques virais de vírus de hepatite E (HEV) para infectar eficientemente as células hepatomas. Com o método apresentado, tanto não envolta, quanto partículas virais envoltas podem ser colhidas e utilizadas para inocular várias linhas celulares.
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Artigo de método
Um modelo de cultura celular para produzir estoques de vírus de hepatite E de alta titer
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
O vírus da hepatite E é a principal causa de cirrose hepática e insuficiência hepática com prevalência crescente em todo o mundo. O vírus RNA de uma única cadeia é predominantemente transmitido por transfusões de sangue, condições sanitárias inadequadas e produtos alimentares contaminados. Até o momento, a droga fora do rótulo ribavirin (RBV) é o tratamento de escolha para muitos pacientes. No entanto, um tratamento específico de HEV ainda precisa ser identificado. Até agora, o conhecimento sobre o ciclo de vida hev e a patogênese tem sido severamente dificultado devido à falta de um sistema eficiente de cultura celular HEV. Um sistema de cultura celular robusto é essencial para o estudo do ciclo de vida viral que também inclui a patogênese viral. Com o método descrito aqui pode-se produzir titers virais de até 3 x 106 unidade de formação de foco/mL (FFU/mL) de HEV não envolto e até 5 x 104 FFU/mL de HEV envolto. Usando essas partículas, é possível infectar uma variedade de células de diversas origens, incluindo células primárias e humanas, bem como linhas de células animais. A produção de partículas infecciosas de HEV a partir de plasmídeos representa uma fonte infinita, o que torna este protocolo extremamente eficiente.
Introdução
A hepatite E é uma doença bastante subestimada com aumento da prevalência em todo o mundo. Cerca de 20 milhões de infecções resultam em mais de 70.000 mortes por ano1. O agente subjacente, o vírus da Hepatite E (HEV), foi transferido recentemente e agora é classificado dentro da família Hepeviridae, incluindo os gêneros Ortohepevirus e Piscihepevirus. HEV de várias origens são classificados dentro da espécie Orthohepevirus A-D, incluindo isolados de humanos, suínos, coelhos, ratos, aves e outros mamíferos2. Atualmente, foram identificados oito genótipos diferentes (GT) do vírus RNA de rna de apenas encalhe posit....
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Protocolo
NOTA: Todos os experimentos são realizados sob a condição BSL-2. Todos os materiais que entram em contato com o vírus da hepatite E RNA ou vírus infeccioso devem ser enxaguados adequadamente com 4% de Kohrsolin FF de um recipiente de resíduos dentro do capô antes do descarte.
1. Preparação plasmid
- Inoculado 200 mL LB médio contendo 100 μg/mL ampicillin com Escherichia coli JM109 transformado incorporando uma codificação plasmida para a sequência HEV gt3 Kernow-C1p6 de comprimento completo (pBluescript_SK_HEVp6 [JQ679013]54 ou pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37). Incubar por 16 h ....
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Resultados
Neste protocolo, descrevemos a produção de alto título infeccioso HEVcc. O primeiro passo é isolar o DNA plasmídeo (pBluescript_SK_HEVp654 e pBluescript_SK_HEVp6-G1634R37, Figura 8a), que então é linearizado pela digestão de restrição e purificado para transcrição in vitro(Figura 1). Uma linearização bem sucedida pode ser verificada comparando o plasmídeo-DNA não digerido com o plasmídeo digerido-DNA usando eletrof.......
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Discussão
A partir da preparação plasmida, os rendimentos de DNA devem exceder 150 ng/μL para poder realizar uma linearização múltipla a partir do mesmo estoque plasmídeo, o que minimiza o risco de mutagênese induzida por bactérias de sequências de genomas cruciais. Além disso, é importante verificar a digestão de restrição para a linearização plasmida completa por eletroforese gel (Figura 8b). A falta de DNA plasmídeo linearizado induziria a amplificação do círculo de rolamento fazendo com que a tran.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Somos gratos a Suzanne Emerson pelo vírus da hepatite E clone p6. O soro hiperimune de coelho específico do HEV foi gentilmente fornecido por Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemanha. Além disso, agradecemos a todos os membros do Departamento de Virologia Molecular e Médica da Universidade ruhr Bochum pelo apoio e discussão. Foram gerados números 1-7 com BioRender.com.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,45 µ m mesh | Sarstedt | 83.1826 | Colheita de vírus extracelular |
| 4% Histofix | CarlRoth | P087.4 | Imunofluorescência |
| Ácido acético | CarlRoth | 6755.1 | Solução de trabalho de colágeno |
| Amicon Ultra-15 | Merck Millipore | UFC910024 | Colheita de vírus |
| Ampicilina | Sigma-Aldrich | A1593 | Seleção de transformados bactérias |
| ATP | Roche | 11140965001 | in vitro transcrição e eletroporação |
| BioRender | BioRender | Figure Generation | |
| CaCl2 | Roth | 5239.2 | Cytomix |
| Collagen R solution 0,4% estéril | Serva | 47256.01 | Solução de trabalho de colágeno |
| CTP | Roche | Transcrição 11140922001in vitro | |
| Cubeta | Biorad | 165-2088 | Eletroporação |
| DAPI | Invitrogen | D21490 | Imunofluorescência |
| DMEM | gibco | 41965-039 | Cultura celular |
| DNAse | Promega | M6101 | in vitro transcrição |
| DTT | Promega | P2077 | in vitro |
| EGTA | Roth | 3054.3 | Cytomix |
| Escherichia coli JM109 | Promega | L2005 | Transformação |
| Soro fetal bovino | gibco | 10270106 | Cultura de células |
| Fluoromount | SouthernBiotech | 0100-01 | Imunofluorescência |
| Sistema de Eletroporação GenePulser Xcell | BioRad | 1652660 | Eletroporação |
| Gentamicina | gibco | 15710049 | Cultura celular |
| GTP | Roche | 11140957001 | in vitro transcrição |
| H2O | Braun | 184238001 | Imunofluorescência |
| Hepes | Invitrogen | 15630-03 | Cytomix |
| Soro de cavalo | gibco | 16050122 | imunofluorescência |
| K2HPO4 | Roth | P749.1 | Cytomix |
| KCL | Roth | 6781.3 | Cytomix |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | Cytomix |
| L-Glutamina | gibco | 25030081 | Cultura de células |
| L-Glutationa reduzida | Sigma-Aldrich | G4251-5G | Cytomix |
| MEM | gibco | 31095-029 | Cultura de células |
| MEM NEAA (100 vezes;) | gibco | 11140-035 | Cultura celular |
| MgCl2 | Roth | 2189.2 | Cytomix |
| Microvolume UV-Vis espectrofotômetro NanoDrop One | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Concentração de DNA/RNA |
| Enzima MluI | NEB | R0198L | Linearização |
| Tampão NEB | NEB | Linearização | |
| R0198LKit de plasmídeo NucleoSpin | Macherey & Nagel | 740588.250 | Preparação de plasmídeo |
| NucleoSpin RNA Clean-up Kit | Macherey & Nagel | 740948.250 | Purificação de RNA |
| PBS | gibco | 70011051 | Cultura de células |
| Pen/Strep | Thermo Fisher | 15140122 | Cultura de células |
| Plasmídeo que codifica o genoma HEV de comprimento total (p6_G1634R) | Todt et.al | Produção de vírus | |
| Plasmídeo que codifica o genoma HEV de comprimento total (p6_WT) | Shukla et al. | Nº de acesso ao GenBank JQ679013 | Produção de vírus |
| Anticorpo primário 1E6 | LS-Bio | C67675 | Imunofluorescência |
| Anticorpo primário 8282 | Rainer Ulrich, Instituto Friedrich Loeffler, Alemanha | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Extração de DNA |
| Ribo m7G Cap Analógico | Promega | P1711 | in vitro transcrição |
| RNase afastado | CarlRoth | A998.3 | Purificação |
| RNA RNasin (inibidor de RNase) | Promega | N2515 | in vitro transcrição |
| Anticorpo secundário anti-rato de burro 488 | Thermo Fisher | A-21202 | Imunofluorescência |
| Anticorpo secundário anti-coelho de cabra 488 | Thermo Fisher | A-11008 | Imunofluorescência |
| Sódio Pyruvat | gibco | 11360070 | Cultura de células |
| T7 RNA polimerase | Promega | P2077 | in vitro transcrição |
| Tampão de transcrição | Promega | P2077 | in vitro |
| Triton X-100 | CarlRoth | 3051.3 | Imunofluorescência |
| Tripsina-EDTA (0,5 %) | gibco | 15400054 | Cultura |
| celular IgG ultrabaixa | gibco | 1921005PJ | Cultura celular |
| UTP | Roche | 11140949001 | in vitro transcrição |
Referências
- Wedemeyer, H., Pischke, S., Manns, M. P. Pathogenesis and treatment of hepatitis e virus infection. Gastroenterology. 142 (6), 1388-1397 (2012).
- Smith, D. B., et al. Proposed reference sequences for hepatitis E virus subtypes. The Journal of General Virology
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Reimpressões e permissões
