यह प्रोटोकॉल क्यूलेक्स क्विंकेफासिटसिटस भ्रूण के लिए माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रियाओं का वर्णन करता है जिन्हें CRISPR/Cas9 जीन संपादन उपकरणों के साथ काम करने के लिए अनुकूलित किया जाता है । यह तकनीक कुशलतापूर्वक साइट-विशिष्ट, वंशानुबल, जर्मलाइन म्यूटेशन उत्पन्न कर सकती है जिसका उपयोग इस अंडरअड्डा रोग वेक्टर में आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों के निर्माण के लिए किया जा सकता है।
क्यूलेक्स क्विंक्विफासिटस एवियन मलेरिया, वेस्ट नील वायरस (डब्ल्यूएनवी), जापानी इंसेफेलाइटिस, पूर्वी घोड़े इंसेफेलाइटिस, लिम्फेटिक फाइलेरिया, और सेंट लुइस इंसेफेलाइटिस जैसे वेक्टर जनित रोगों की एक विविध श्रृंखला का वेक्टर है। विशेष रूप से, एवियन मलेरिया ने कई स्थानिक द्वीप पक्षी प्रजातियों के विलुप्त होने में एक प्रमुख भूमिका निभाई है, जबकि WNV संयुक्त राज्य अमेरिका में एक महत्वपूर्ण वेक्टर जनित रोग बन गया है । सी क्विंक्विफासियस जीव विज्ञान में और अधिक जानकारी हासिल करने और उनके आनुवंशिक नियंत्रण टूलबॉक्स का विस्तार करने के लिए, हमें इस प्रजाति में जीनोम इंजीनियरिंग के लिए और अधिक कुशल और किफायती तरीके विकसित करने की आवश्यकता है। हालांकि, क्यूलेक्स मच्छरों, विशेष रूप से उनके अंडे राफ्ट के लिए अद्वितीय कुछ जैविक लक्षणों ने जीनोम इंजीनियरिंग के लिए आवश्यक माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रियाओं को करना मुश्किल बना दिया है। इन चुनौतियों से निपटने के लिए, हमने एक अनुकूलित भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित किया है जो क्यूलेक्स मच्छरों की अनूठी विशेषताओं से जुड़ी तकनीकी बाधाओं को कम करने पर केंद्रित है। ये प्रक्रियाएं अंडे के संग्रह, अंडा बेड़ा जुदाई और सी क्विंक्विफासियस में सफल माइक्रोइंजेक्शन के लिए आवश्यक अन्य हैंडलिंग प्रक्रियाओं के लिए अनुकूलित तरीकों को प्रदर्शित करती हैं। जब CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के साथ युग्मित, इन प्रक्रियाओं हमें साइट विशिष्ट, कुशल और वंशानुबल जर्मलाइन उत्परिवर्तन, जो उन्नत जीनोम इंजीनियरिंग प्रदर्शन और इस महत्वपूर्ण में आनुवंशिक नियंत्रण प्रौद्योगिकियों का विकास करने के लिए आवश्यक है प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं, लेकिन वर्तमान में अध्ययन, रोग वेक्टर ।
सी क्विंक्विफासिटसिटस,जिसे आमतौर पर दक्षिणी घर मच्छर के रूप में जाना जाता है, पश्चिम नील वायरस (डब्ल्यूएनवी), जापानी इंसेफेलाइटिस, सेंट लुइस इंसेफेलाइटिस और पूर्वी घोड़े इंसेफेलाइटिस सहित कई रोगजनकों का एक सक्षम वेक्टर है। विशेष रूप से, चूंकि यह पहली बार 1999 में न्यूयॉर्क में पाया गया था, WNV महाद्वीपीय संयुक्त राज्य अमेरिका (अमेरिका) भर में एक प्रमुख वेक्टर जनित रोग बन गया है 50,000 से अधिक मानव मामलों की सूचना दी 1999 और2018 1 के बीच लगभग 2,300 मौतों के साथ-साथ 4,500 से अधिक 2008-20192 के बीच ईक्वीन मामलों की सूचना दी. इसके अलावा, उत्तरी अमेरिका में पाई जाने वाली कम से कम 23 पक्षी प्रजातियों को डब्ल्यूएनवी3के परिणामस्वरूप अप्राप्य के रूप में वर्गीकृत कम से कम 12 प्रजातियों के साथ WNV संक्रमणों से प्रभावित किया गया है। मानव, घोड़े और एवियन आबादी पर WNV का प्रभाव इसके वैक्टर के अवसरवादी भोजन व्यवहार के कारण है। आमतौर पर, पक्षी WNV के लिए प्राथमिक मेजबान हैं, और मनुष्य और घोड़े आकस्मिक या मृत अंत मेजबान हैं। सी क्विंक्विफासिटसिटस द्वारा कुछ रोगजनक केवल एवियन मलेरिया परजीवी, प्लाज्मोडियम रेलिटमजैसे पक्षियों को संक्रमित करते हैं। हवाई में, सी क्विंक्विफासियस एवियन मलेरिया का एक प्रमुख वेक्टर है और इसने कई देशी पक्षी प्रजातियों के विलुप्त होने का कारण बना दिया है4,5।
सी क्विंक्विफासिटसिटसद्वारा प्रेषित रोगों को नियंत्रित करने के लिए, शोधकर्ताओं और वेक्टर नियंत्रण एजेंसियों ने कीटनाशक आवेदनजैसेआमतौर पर स्थापित मच्छर जनसंख्या नियंत्रण उपकरणों का उपयोग किया है, हालांकि, ये विधियां महंगी हैं, प्रजातियों-विशिष्ट नहीं हैं, और सीमित प्रभावशीलता है क्योंकि कीटनाशकों के प्रतिरोध में कई सी क्विंक्विफास्सिया आबादी 6,7,8,9में अधिक है। वुलबाचियाआधारित जनसंख्या नियंत्रण रणनीतियों जैसी अन्य नियंत्रण तकनीकों को हाल के वर्षों मेंविकसितकिया गयाहै,लेकिन वुलबाचिया संक्रमण से जुड़ी फिटनेस लागत इस वेक्टर12के लिए इस दृष्टिकोण की व्यवहार्यता को सीमित करते हैं । अन्य मच्छरों की प्रजातियों जैसे एडीज एजिप्टी13,14, एनोफेल्स गाम्बियाई15 और एनोफेल्स स्टीफेंसी16 में जेनेटिक बेस्ड कंट्रोल विधियां भी विकसित की गई हैं, जिनमें रोगजनक प्रतिरोधी मच्छरोंका विकास17,18,19शामिल है, जो सी क्विंक्फासिया के लिए भी विकसित किए जा सकते हैं यदि जीनोम अपेक्षित इंजीनियरिंग उपकरण हैं इस प्रजाति के लिए विकसित किया गया है। हालांकि, सी क्विंक्फासियस जीव विज्ञान अन्य एडीज और एनोफेल्स मच्छर वैक्टर से बहुत अलग है जिसने इस वेक्टर में समान आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों के विकास को मुश्किल बना दिया है। CRISPR आधारित जीनोम इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों के आगमन के साथ, सटीक जीनोम इंजीनियरिंग तेजी से तुच्छ, सस्ती और अनुकूलनीय हो गया है और फलस्वरूप प्रजातियों की एक विस्तृत विविधता में उपन्यास आनुवंशिक उपकरणों के विकास के लिए नेतृत्व किया गया है ।
CRISPR आधारित प्रौद्योगिकियों के साथ उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए, Cas9 प्रोटीन और सिंथेटिक गाइड आरएनए (sgRNA), वांछित loci के पूरक का मिश्रण, पूर्व blastoderm चरण भ्रूण में microinjected है । चूंकि सी क्विंक्विफासिटस मादाएं एक फ्लोटिंग बेड़ा संरचना(चित्रा 1)में संलग्न समूहों में अपने अंडे डालती हैं, जैसा कि व्यक्तिगत अंडों को ओविपोसिटिंग करने के विपरीत, एडीज और एनोफेल्स मच्छरों की एक विशेषता, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन इस प्रजाति में तेजी से जटिल हैं। क्यूलेक्स लार्वा प्रत्येक अंडे के पूर्वकाल पक्ष से भी निकलता है, जो पानी की सतह(चित्रा 1)के संपर्क में है, इसलिए इस प्रजाति में अंडा अभिविन्यास पोस्ट हेरफेर महत्वपूर्ण है। यहां हम सी क्विंक्विफासिटस भ्रूण में Cas9 प्रोटीन और sgRNA के माइक्रोइंजेक्शन के लिए डिज़ाइन किए गए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ कदम है कि समय पर अंडा संग्रह और अंडे के अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है के माध्यम से भ्रूण अस्तित्व और जीनोम उत्परिवर्तन दरों में सुधार करने के लिए Culex जीव विज्ञान के लिए अद्वितीय लक्षण को समायोजित करने के लिए डिजाइन किया गया है ।
मच्छर वेक्टर नियंत्रण के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर उपकरण उत्पन्न करने के लिए हाल के प्रयासों के साथ, आम मच्छर रोग वैक्टर के लिए भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित करने की आवश्यकता है। हालांकि एडीज और एनोफेल्स मच्छरों के लिए तरीके विकसित किए गए हैं, लेकिन विशेष रूप से क्यूलेक्स के लिए डिजाइन किए गए एक प्रोटोकॉल का न्यूनतम पता लगाया गया है। सामान्य मच्छर भ्रूण इंजेक्शन प्रोटोकॉल में 3 सामान्य चरणों में विभाजित किया जा सकता है: 1) भ्रूण संग्रह और तैयारी, 2) भ्रूण इंजेक्शन, और 3) इंजेक्शन के बाद वसूली। म्यूटेंट को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए, लक्षित प्रजातियों के लिए सभी तीन चरणों को अनुकूलित किया जाना चाहिए। भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन के लिए यह संशोधित प्रोटोकॉल क्यूलेक्स मच्छरों के सफल जीनोम इंजीनियरिंग के लिए विशिष्ट है।
भ्रूण संग्रह को अधिकतम करना भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन प्रोटोकॉल में एक आम अड़चन है। थोड़े समय में एकत्र किए गए अंडों की संख्या बढ़ाने के लिए, मच्छरों को रक्त भोजन के बाद 2-3 दिनों के लिए एक अंडाशय सब्सट्रेट से प्रतिबंधित किया गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि सी क्विंक्विफासियस स्तनधारी स्रोतों या स्तनधारी रक्त के साथ झिल्ली खिलाने के विपरीत एवियन रक्त स्रोतों को पसंद करते हैं। हालांकि, कई शोधकर्ताओं को रक्त आहार के लिए जीवित एवियन या एवियन रक्त का विश्वसनीय स्रोत प्राप्त करने में कठिनाई होती है, इसलिए प्रयोगशाला स्टॉक को अधिक सुलभ रक्त स्रोतों पर खिलाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। ओविपोशन सब्सट्रेट के लिए पोषक तत्वों से भरपूर पानी का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह सी क्विंक्विफासिटसिटस और अधिकांश अन्य क्यूलेक्स वैक्टर के लिए ओविपोजिशन संकेत प्रदान करता है। पोषक तत्वों से भरपूर पानी उत्पन्न करने के लिए कई तरीके हैं, जिन्हें प्रयोगशालाओं के बीच अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माइक्रोइंजेक्शन के लिए उचित संख्या में अंडे उपलब्ध हैं। उदाहरण के लिए, जबकि यह विधि खरगोश मल के साथ सबसे सफल थी जो 5 या अधिक दिनों के लिए डिओनाइज्ड पानी में किण्वित थी, अन्य शोधकर्ताओं को पोषक तत्व स्रोत के रूप में घास या मछली के भोजन के साथ अधिक सफलता मिलती है और कुछ आसुत पानी के साथ भी21।
चूंकि क्यूलेक्स मच्छर राफ्ट में अंडे के समूह लगाते हैं, इसलिए अंडे इकट्ठा करना काफी सरल है। अंडे को बस एक तूलिका के साथ पूरे बेड़ा स्कूपिंग द्वारा एकत्र किया जा सकता है। अंडा जुदाई अधिक जटिल है, लेकिन सफल इंजेक्शन के लिए आवश्यक है। अंडे को तूलिका या संदंश के साथ अंडे के बीच कोमल नीचे दबाव लागू करके बेड़ा से सावधानीपूर्वक अलग किया जा सकता है। कुछ अभ्यास के साथ, कई उपयोगकर्ता अंडे राफ्ट से एकल अंडे को अलग करने में मज़बूती से सक्षम थे। प्रत्येक अंडे को अलग करने के बाद, अंडे को दो तरफा चिपचिपा टेप पर एक ही अभिविन्यास में गठबंधन किया जाता है, जो माइक्रोइंजेक्शन के दौरान अंडों को स्थिर करता है। अंडे पतला पीछे के अंत में इंजेक्शन कर रहे हैं और हेलोकार्बन तेल के अलावा हेरफेर के दौरान अंडे नम रहता है।
माइक्रोइंजेक्शन के दौरान भ्रूण क्षति को सीमित करने के लिए, इंजेक्शन सुइयों को उचित शक्ति की आवश्यकता होती है और उचित कोण पर beveled की आवश्यकता होती है। एल्यूमिनोसिलिकेट सुई एक 50 डिग्री कोण पर 10 सेकंड के लिए beveled सबसे अच्छा परिणाम था, लेकिन बोरोसिलिकेट और क्वार्ट्ज सुई भी काम कर सकते हैं, भले ही वे कम टिकाऊ और अधिक महंगा हो सकता है। इसके अलावा, उचित सुई beveling Cas9 और sgRNA मिश्रण के बेहतर प्रवाह की सुविधा और भ्रूण में आसान प्रवेश के लिए एक तेज बिंदु बनाता है । कई मामलों में, beveling भी एक कुशल तरीका है जल्दी से भरा सुई को ठीक करने के बजाय समय और भरा हुआ सुई की जगह प्रयास खर्च करने के लिए है ।
इंजेक्शन के बाद, अंडे को कम से कम 5 मिनट तक अव्यवस्थित रहना चाहिए, जिसमें हेलोकार्बन तेल को तुरंत बाद हटा दिया जाना चाहिए। हेलोकार्बन तेल को हटाने के बाद, इंजेक्शन अंडे को हैच करने के लिए पानी में रखा जा सकता है, जो आमतौर पर इंजेक्शन के बाद 3 दिनों के भीतर होता है। अभ्यास और पर्याप्त संख्या में अंडे के साथ, यह प्रोटोकॉल सी क्विंकेफासिटसिटसिटस में लगातार दैहिक और जर्मलाइन उत्परिवर्तन प्राप्त कर सकता है और बहुमुखी है कि यह अन्य क्यूलेक्स मच्छरों के लिए आसानी से अनुकूलनीय होना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को ओ.एस.ए. को निर्देशित UCSD स्टार्टअप फंड द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।
9 oz clear plastic pet cup | Karat | C-KC9 | Insect Rearing and Egg Collection |
Aluminosilicate glass capillary tubing 1mm(outside diameter) X 0.58mm (inner diameter) | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Microinjection, borosilicate and quartz needles could also be used but we prefered aluminosilicate |
Blood | Colorado Serum Company | 31025 | The colony took multiple generations to adapt to this blood source. Other blood sources are likely just as appropriate. See protocol notes on blood source selection. |
Bugdorm | Bugdorm | 4F2222 | Insect Rearing Cage |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | Microinjection |
Compound Microscope | Olympus BX41 | Microinjection, for embryo injection | |
Diamond abrasive plate (0.7u to 2.0u tip sizes) | Sutter Instruments | 104E | Microinjection, to be used with beveler |
DNase/RNase-Free distilled Water | Invitrogen | 10977-015 | Microinjection |
Double-sided Tape | Scotch | B084NVQGXD | Microinjection, embryo alignment |
Femtojet 4x or 4i programmable microinjector | Eppendorf | Microinjection | |
Femtotips Microloader tips | Fisher Scientific | E5242956003 | Microinjection |
Filter Paper | Whatman | 1001-090 | Microinjection, embryo collection |
Fine-tip paintbrush | ZEM | 2595 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773 | Microinjection, embryo alignment |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898 | Microinjection, embryo alignment |
Hemotek | Hemotek | PS5 | Line Maintenance |
Microelectrode Beveler | Sutter Instruments | BV10 | Microinjection, needle beveling |
Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 or P-2000 | Microinjection, needle pulling |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-A3 | Microinjection, embryo alignment |
Non-Drying Modeling Clay | Jovi | B0025Z71IM | Microinjection, needle storage |
Stereo Microscope | Olympus | SZ51 | Microinjection, for embryo alignment |
Sugar | Domino | 20% sugar solution for adult sugar source. | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302 | Preparation of microinjection materials |
TOPO TA Cloning Kit | ThermoFischer Scientific | K451020 | Preparation of microinjection materials |
Ultra-fine tip forceps | Fisher Scientific | 16-100-121 | Microinjection, embryo alignment |