Opprette matchede in vivo/in vitro pasientavledede modellpar av PDX- og PDX-avledede organoider for kreftfarmakologiforskning
Summary
En metode er beskrevet for å lage organoider ved hjelp av pasientavledede xenografts (PDX) for in vitro screening, noe som resulterer i matchede par in vivo / in vitro-modeller. PDX-svulster ble høstet/behandlet i små biter mekanisk eller enzymatisk, etterfulgt av Clevers’ metode for å dyrke tumororganoider som ble passasjert, kryopreservert og karakterisert mot den opprinnelige PDX.
Abstract
Pasientavledede tumor xenografts (PDXs) regnes som de mest prediktive prekliniske modellene, i stor grad antatt å være drevet av kreft stamceller (CSC) for konvensjonell kreft narkotika evaluering. Et stort bibliotek med PDX-er gjenspeiler mangfoldet i pasientpopulasjoner og muliggjør dermed befolkningsbaserte prekliniske studier (“Fase II-lignende muse kliniske studier”); PDX har imidlertid praktiske begrensninger med lav gjennomstrømning, høye kostnader og lang varighet. Tumororganoider, som også er pasientavledede CSC-drevne modeller, kan betraktes som in vitro-ekvivalenten til PDX, og overvinne visse PDX-begrensninger for å håndtere store biblioteker av organoider eller forbindelser. Denne studien beskriver en metode for å lage PDX-avledede organoider (PDXO), noe som resulterer i parrede modeller for in vitro- og in vivo farmakologiforskning. Subkutant transplanterte PDX-CR2110 svulster ble samlet inn fra tumorbærende mus da svulstene nådde 200-800 mm3, per en godkjent obduksjonsprosedyre, etterfulgt av fjerning av tilstøtende ikke-tumorvev og dissosiasjon i små tumorfragmenter. De små tumorfragmentene ble vasket og passert gjennom en 100 μm cellesil for å fjerne rusk. Celleklynger ble samlet inn og suspendert i kjellermembranekstrakt (BME) oppløsning og belagt i en 6-brønns plate som en solid dråpe med omkringliggende flytende medier for vekst i en CO 2-inkubator. Organoid vekst ble overvåket to ganger ukentlig under lysmikroskopi og innspilt av fotografering, etterfulgt av flytende medium endring 2 eller 3 ganger i uken. De voksne organoidene ble ytterligere viderepassert (7 dager senere) med et 1:2-forhold ved å forstyrre BME innebygde organoider ved hjelp av mekanisk skjæring, hjulpet av tilsetning av trypsin og tilsetning av 10 μM Y-27632. Organoider ble kryopreservert i kryorør for langtidslagring, etter frigjøring fra BME ved sentrifugering, og også samplet (f.eks. DNA, RNA og FFPE-blokk) for videre karakterisering.
Introduction
Kreft er en samling av ulike genetiske og immunologiske lidelser. Vellykket utvikling av effektive behandlinger er svært avhengig av eksperimentelle modeller som effektivt forutsier kliniske resultater. Store biblioteker med godt karakteriserte pasientavledede xenografts (PDX) har lenge blitt sett på som det translasjonelle in vivo-systemet som er valgt for å teste kjemo- og/eller målrettede terapier på grunn av deres evne til å rekapitulere pasientsvulstegenskaper, heterogenitet og pasientmedisinrespons1, slik at fase II-lignende muse kliniske studier kan forbedre klinisk suksess2,3. PDXer betraktes generelt som kreft stamcellesykdommer, med genetisk stabilitet, i motsetning til cellelinje avledet xenografts2. I løpet av de siste tiårene har store samlinger av PDXs blitt opprettet over hele verden, og blitt arbeidshest for utvikling av kreftmedisin i dag. Selv om de er mye brukt og med stor translasjonsverdi, er disse dyremodellene iboende kostbare, tidkrevende og lave gjennomstrømning, derfor utilstrekkelige for storskala screening. PDX er også uønsket for immuno-onkologi (IO) testing på grunn av en immunkompliserte natur4. Det er derfor upraktisk å dra full nytte av det tilgjengelige store biblioteket med PDXs.
Nylige funn, pionerer av Hans Clevers ‘ laboratorium5, har ført til etableringen av in vitro kulturer av organoider generert fra voksne stamceller i de fleste menneskelige organer av epitel opprinnelse5. Disse protokollene har blitt ytterligere raffinert for å tillate vekst av organoider fra antattE CSC-er i humane karsinomer av ulikeindikasjoner 6,7. Disse pasientavledede organoidene (PUD) er genomisk stabile8,9 og har vist seg å være svært prediktive for kliniske behandlingsutfall10,11,12. I tillegg muliggjør IN VITRO-naturen til PUD-er høy gjennomstrømningsscreening (HTS)13, og gir dermed potensielt en fordel i forhold til in vivo-modeller og utnytter store organoidbiblioteker som en surrogat av pasientpopulasjonen. PUD-er er klar til å bli en viktig oppdagelses- og oversettelsesplattform, og overvinner de mange begrensningene til PDXer beskrevet ovenfor.
Både PUD og PDX er pasientavledede og CSC-drevne modeller, med evne til å evaluere terapeutiske behandlinger i sammenheng med enten personlig behandling eller klinisk studieformat. Eksisterende store biblioteker av PDXs, som den proprietære samlingen av >3000 PDXs14,15,16,17, er derfor egnet for rask generering av biblioteker av tumororganoider (PDX-avledede organoider eller PDXO), noe som resulterer i et matchet bibliotek med parrede PDX- og PDXO-modeller. Denne rapporten beskriver prosedyren for å skape og karakterisere kolorektal kreft PDXO-CR2110 i forhold til foreldre PDX-CR2110 modell16.
Protocol
Representative Results
Discussion
De foreløpige dataene for PDX-/PDXO-CR2110 i denne rapporten støtter den biologiske ekvivalensen mellom PDX og dets derivat, PDXO, med hensyn til genomikk, histopatologi og farmakologi, siden begge modellene representerer sykdomsformene avledet fra den opprinnelige CSC av pasienten. Begge modellene er pasientavledede sykdomsmodeller, potensielt prediktive for pasientenes kliniske respons10,11,12,21…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi og Rajendra Kumari for kritisk lesing og redigering av manuskriptet. Forfatterne vil også takke Crown Bioscience Oncology in vitro og in vivo team for deres store tekniske innsats.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
Referências
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Pesquisa do Câncer. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
