Skapa matchade in vivo/in vitro patient-härledda modellpar av PDX och PDX-härledda organoider för cancerfarmakologi forskning
Summary
En metod beskrivs för att skapa organoider med patientbaserade xenografter (PDX) för in vitro-screening, vilket resulterar i matchade par in vivo/in vitro-modeller. PDX tumörer skördades/bearbetades i små bitar mekaniskt eller enzymatically, följt av Clevers metod att odla tumör organoider som passages, cryopreserved och karakteriseras mot den ursprungliga PDX.
Abstract
Patient-härledda tumör xenografts (PDX) anses vara de mest prediktiva prekliniska modellerna, som till stor del tros drivas av cancerstamceller (CSC) för konventionell cancerläkemedelsutvärdering. Ett stort bibliotek med PDX återspeglar mångfalden av patientpopulationer och möjliggör därmed populationsbaserade prekliniska prövningar (“Fas II-liknande mus kliniska prövningar”); PDX har dock praktiska begränsningar av lågt genomströmning, höga kostnader och lång varaktighet. Tumörorganoider, som också är patientbaserade CSC-drivna modeller, kan betraktas som in vitro-motsvarigheten till PDX, vilket övervinner vissa PDX-begränsningar för att hantera stora bibliotek av organoider eller föreningar. Denna studie beskriver en metod för att skapa PDX-härledda organoider (PDXO), vilket resulterar i parade modeller för in vitro- och in vivo-farmakologiforskning. Subkutant-transplanterade PDX-CR2110 tumörer samlades in från tumör-bärande möss när tumörer nådde 200-800 mm3, enligt en godkänd obduktion förfarande, följt av avlägsnande av angränsande icke-tumör vävnader och dissociation i små tumör fragment. De små tumörfragmenten tvättades och passerade genom en 100 μm cellsil för att ta bort skräpet. Cellkluster samlades in och suspenderades i källaren membran extrakt (BME) lösning och pläteras i en 6-brunnsplatta som en fast droppe med omgivande flytande medier för tillväxt i en CO2 inkubator. Organoid tillväxt övervakades två gånger i veckan under lätta mikroskopi och registreras genom fotografering, följt av flytande medium förändring 2 eller 3 gånger i veckan. De odlade organoiderna passagerades ytterligare (7 dagar senare) vid ett 1:2-förhållande genom att störa BME inbäddade organoider med mekanisk savning, med hjälp av tillsats av trypsin och tillsats av 10 μM Y-27632. Organoider var cryopreserved i cryo-tubes för långsiktig lagring, efter utsläpp från BME genom centrifugering, och även provsmakas (t.ex. DNA, RNA och FFPE block) för ytterligare karakterisering.
Introduction
Cancer är en samling olika genetiska och immunologiska störningar. Framgångsrik utveckling av effektiva behandlingar är starkt beroende av experimentella modeller som effektivt förutsäger kliniska resultat. Stora bibliotek av väl karakteriserade patient-härledda xenografts (PDX) har länge betraktats som det translationella in vivo-systemet för att testa cellgifter och/ eller riktade terapier på grund av deras förmåga att rekapitulera patientens tumöregenskaper, heterogenitet och patientläkemedelssvar1, vilket möjliggör fas II-liknande mus kliniska prövningar för att förbättra kliniskframgång 2,3. PDX anses i allmänhet vara cancerstamcellssjukdomar, med genetisk stabilitet, i motsats till cellinje härledda xenografts2. Under de senaste decennierna har stora samlingar av PDX skapats över hela världen och blivit arbetshästen för utveckling av cancerläkemedel idag. Även om de används i stor utsträckning och med stort translationellt värde är dessa djurmodeller i sig kostsamma, tidskrävande och låga genomströmning, därför otillräckliga för storskalig screening. PDX är också oönskade för immunonkologi (IO) testning på grund av att en immun-komprometterad natur4. Det är därför opraktiskt att dra full nytta av det tillgängliga stora biblioteket med PDX.
Nya upptäckter, pionjärer av Hans Clevers laboratorium5, har lett till upprättandet av in vitro-kulturer av organoider som genereras från vuxna stamceller i de flesta mänskliga organ av epitelialt ursprung5. Dessa protokoll har förfinats ytterligare för att möjliggöra tillväxt av organoider från förmodade CSCs i humant carcinom av olikaindikationer 6,7. Dessa patient-härledda organoider (PDO) är genomiskt stabila8,9 och har visat sig vara mycket prediktiva för kliniska behandlingsresultat10,11,12. Dessutom möjliggör pdos in vitro-karaktär screening med hög genomströmning (HTS)13, vilket potentiellt erbjuder en fördel jämfört med in vivo-modeller och utnyttjar stora organoidbibliotek som surrogat hos patientpopulationen. PDO:er är redo att bli en viktig identifierings- och översättningsplattform som övervinner de många begränsningarna i PDX som beskrivs ovan.
Både PDO och PDX är patientbaserade och CSC-drivna modeller, med förmågan att utvärdera terapier i samband med antingen personlig behandling eller kliniskt prövningsformat. Befintliga stora bibliotek av PDX, som den proprietära samlingen av >3000 PDXs14,15,16,17, är därför lämpliga för snabb generering av bibliotek av tumörorganoider (PDX-härledda organoider eller PDXO), vilket resulterar i ett matchat bibliotek med parade PDX- och PDXO-modeller. I den här rapporten beskrivs proceduren för att skapa och karakterisera kolorektalcancer PDXO-CR2110 i förhållande till dess föräldra-PDX-CR2110-modell16.
Protocol
Representative Results
Discussion
De preliminära uppgifterna för PDX-/PDXO-CR2110 i denna rapport stöder den biologiska motsvarigheten mellan PDX och dess derivat PDXO när det gäller genomik, histopatologi och farmakologi, eftersom båda modellerna representerar de sjukdomsformer som härrör från patientens ursprungliga CSC. Båda modellerna är patientbaserade sjukdomsmodeller, potentiellt prediktiva för det kliniska svaret hos patienter10,11,12,</…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi och Rajendra Kumari för kritisk läsning och redigering av manuskriptet. Författarna vill också tacka Crown Bioscience Oncology in vitro och in vivo-teamet för deras stora tekniska insatser.
Materials
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634028 | Base medium |
| DMEM | Hyclone | SH30243.01 | Washing medium |
| Collagenese type II | Invitrogen | 17101015 | Digest tumor |
| Matrigel | Corning | 356231 | Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced) |
| N-Ac | Sigma | A9165 | Organoid culture medium |
| A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid culture medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Organoid culture medium |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Organoid culture medium |
| Noggin | Peprotech | 120-10C | Organoid culture medium |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 | Organoid culture medium |
| SB202190 | Sigma | S7076 | Organoid culture medium |
| Gastrin | Sigma | G9145 | Organoid culture medium |
| Rspondin | Peprotech | 120-38-1000 | Organoid culture medium |
| L-glutamine | Life Technologies | 35050038 | Organoid culture medium |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | Organoid culture medium |
| penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15140122 | Organoid culture medium |
| Y-27632 | Abmole | M1817 | Organoid culture medium |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | Screening assay |
| CellTiter-Glo 3D | Promega | G9683 | Screening assay (luminescent ATP indicator) |
| Multidrop dispenser | Thermo Fisher | Multidrop combi | Plating organoids/CellTiter-Glo 3D addition |
| Digital dispener | Tecan | D300e | Compound addition |
| Envision Plate reader | Perkin Elmer | 2104 | Luminescence reading |
| Balb/c nude mice | Beijing HFK Bio-Technology Co | ||
| RNAeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | tRNA purification kit |
| DNAeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | DNA purification kit |
| Histogel | Thermo Fisher | HG-4000-012 | Organoid embedding |
Referências
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).
- Gao, H., et al. High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response. Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).
- Yang, M., et al. Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients. International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in Cancer Researchearch. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Muthuswamy, S. K. Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities. Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).
- Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Vlachogiannis, G., et al. Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers. Science. 359 (6378), 920-926 (2018).
- Yao, Y., et al. Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer. Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).
- Ganesh, K., et al. A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation. Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Yang, J. P., et al. A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation. Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).
- Zhang, L., et al. A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy. Scientific Reports. 3, 2992 (2013).
- Chen, D., et al. A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations. Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).
- Guo, S., et al. Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines. Pesquisa do Câncer. 76 (16), 4619-4626 (2016).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models. Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).
- Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).
- Corcoran, R. B., et al. Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer. Journal of Clinical Oncology. , (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
