虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル
Summary
ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。
Abstract
虚血性脳卒中は、脳組織の低灌流、酸素およびグルコース欠乏、および結果的な神経喪失を特徴とする臨床状態である。多くの証拠は、グリアと神経細胞の相互作用が虚血性事象の後に有益な効果を発揮することを示唆しています。そのため、潜在的な保護機構を探索するためには、虚血環境におけるニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを開発することが重要です。ここでは、ラット胚性皮質からアストロサイトおよびニューロンを単離する簡単なアプローチを提示し、特定の培養培地を用いて、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養を高収率および再現性で確立することを可能にする。
アストロサイトとニューロンのクロストークを研究するために、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートにメッキされたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムに基づくアプローチを提案する。2つの培養物は、小さなパラフィン球によって離れて維持される。このアプローチは、独立した操作と各細胞タイプへの特定の治療法の適用を可能にし、多くの研究において利点を表している。
虚血性脳卒中中に何が起こるかをシミュレートするために、培養物は酸素およびグルコース剥奪プロトコルに供される。このプロトコルは虚血性脳卒中におけるニューロンとグリア相互作用の役割を研究するのに有用なツールを表す。
Introduction
世界保健機関(WHO)のデータによると、毎年約550万人が虚血性脳卒中で死亡しています。この状態は、ある脳領域への血流の中断によって特徴付けられるが、組織への酸素および栄養素の供給において可逆的または不可逆的な損失をもたらし、組織機能を変化させ、ミトコンドリア機能不全、カルシウム調節障害、グルタミン酸興奮性、炎症および細胞損失22、33を引き起こす。
血管細胞とは別に、神経細胞およびグリア細胞は虚血性脳卒中4の病態生理学に関与している。特に、アストロサイトはニューロンの維持に必須であり、最近では虚血病変5に対する応答において重要な役割を果たすることが示された。このタイプのグリア細胞は、構造的支持の機能を果たす、酸化ストレスに対する防御、神経伝達物質の合成、細胞間通信の安定化、とりわけ6。ニューロンと並んで、アストロサイトはシナプス伝達において直接的な役割を果たし、アデノシン三リン酸、γ-アミノ酪酸およびグルタミン酸7などの分子の放出を調節する。虚血によって引き起こされる傷害の一部は、シナプス裂切れにおけるグルタミン酸の過剰放出およびその蓄積によって引き起こされ、N-メチル-D-アスパラギン酸受容体の過剰活性化につながり、下流シグナル伝達カスケードを活性化し、最終的に興奮性障害をもたらす8を生じる。アストロサイトはシナプス裂膜からグルタミン酸を除去し、グルタミンに変換することができるので、興奮毒性に対する防御に重要であり、それによって虚血に対する神経保護効果を発揮する。これらの細胞はまた、虚血誘発性神経炎症の役割を果たす。虚血性侮辱の後、活性化されたアストロサイトは形態学的変化(肥大)を受け、増殖し、そしてグリア性フィブリリン酸性タンパク質(GFAP)発現の増加を示す。それらは反応性(アストログリオーシス)になり、腫瘍壊死因子-α、インターロイキン-1αおよびインターロイキン-1βなどの炎症性サイトカインを放出し、一酸化窒素およびスーパーオキシドを含むフリーラジカルを産生し、神経死9,1010を誘導することができる。対照的に、反応性アストロサイトはまた、神経保護作用を果たして、脳卒中11後にアップレギュレートされる成長因子βの転換などの抗炎症性サイトカインを放出するのでである。さらに、彼らは、軸索発芽を阻害することによって組織の再生を制限することができるグリア瘢痕を生成することができます。しかし、このグリア瘢痕は、損傷部位を生存可能な組織から隔離することができ、従って制御されていない組織損傷12、13,13のカスケード波を防ぐ。
したがって、虚血性損傷の影響を制限または逆転させる治療戦略を見つけるために、虚血性傷害下でのニューロンとグリアの相互作用を研究できるモデルを確立することが不可欠です。虚血性損傷を研究するために使用される他のモデル、すなわち生体内モデル,14、15、16、,15,16オルガノスティック培養17、18、1918および17急性脳スライス20、21、22,21と比較して、一次細胞培養は複雑性が低く、これは虚血性脳卒中の病態生理学における各細胞型の個々の寄与の研究を可能にする。,2219典型的には、ニューロンエンリッチ培養とアストロサイトエンリッチ培養との相互作用を研究するために、出生後起源のニューロンおよびグリア細胞は、23、24、,24または出生後グリア細胞および胚性ニューロン25、26,26を使用する。本明細書では、同じ組織からニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物およびニューロングリア培養を確立するための簡単なアプローチが提案される。これらの初細胞はラット胚性皮質から得られ、脳卒中27、28,28によって頻繁に影響を受ける領域である。また、組織の解離は機械的な手順によってのみ行われる。したがって、このプロトコルは、開発の同じ段階で、高速かつ安価な方法で、高い性能と再現性で細胞を単離することができます。
アストロサイトとニューロンのクロストークは、カバーリップで培養されたニューロンがマルチウェルプレートに播種されたアストロサイトの単層と接触して維持される共培養システムを使用して探索することができる。小さなパラフィン球体は、2つの細胞培養物の分離を確実にするために使用することができる。この方法では、各セル型が接触する前に、独立した操作が可能になります。例えば、アストロサイトの特定の遺伝子を沈黙させ、それが虚血性損傷に対する神経の脆弱性または保護にどのような影響を与えるかを見ることができます。インビトロで虚血性様条件を誘導する確立された方法は、酸素およびグルコース欠乏(OGD)3であり、これはグルコースの省略に関連するアノキシック雰囲気(95%N2および5%CO2)によって通常の雰囲気(95%空気および5%CO2)を置き換えることから成る。322 2
記載された方法は、虚血性脳卒中の文脈におけるニューロンとアストロサイト間の相互作用を、簡単で、速く、再現可能で安価な方法で研究するのに適している。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、ラット胚性皮質組織からのアストロサイトおよびニューロン分離からなり、ニューロンまたはアストロサイトを豊富に含む培養物またはニューロングリア培養物の確立を可能にする。これは、皮質ニューロングリアとニューロンエンリッチ胚培養が単離され、2つの培養が特徴付けられるグループ5の以前の研究から適応されました。これらの培養を?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、プロジェクトUIDB/00709/2020、POCI-01-0145-FEDER-029311およびフェローシップSFRH/BD/135936/2018を通じて、ファンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジアによる資金援助を認めている。 「プログラム・オペラシオナル・ド・セントロ、セントロ2020」によるプロジェクトCENTRO-01-0145-FEDER-000013、およびプロジェクトPOCI-01-0145-FEDER-022122を通じてバイオイメージングのPPBI-ポルトガルプラットフォームへの資金提供。
Materials
| 24 -well culture plates | Thermo Fischer Scientific | 142475 | |
| 95% N2/5% CO2 gas cylinder | ArLíquido | ||
| Anti-mouse conjugated to Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| Anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | 1/1000 dilution; incubation period – 1 h at room temperature |
| B27 supplement (50x) | Gibco | 17504-044 | |
| Dako Fluorescence Mounting Medium | Dako | S3023 | |
| D-glucose anhydrous | Fisher Scientific | G/0450/60 | 3.4 g/L |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioObserver Z1x | 63x objective |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom | S0615 | 10% |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1272 | 120 µg/mL |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G8415 | 25µM |
| Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | 0.5 mM |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 2 µM; incubation period – 10 min at room temperature |
| Hypoxia incubation chamber | Stemcell Technologies | 27310 | Chamber used for OGD induction |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I5500 | 5 mg/L |
| Ketamine | Sigma-Aldrich | K-002 | 87.5 mg/Kg |
| Minimum Essential Medium Eagle medium | Sigma-Aldrich | M0268 | warm up to 37 °C before use |
| Mouse Anti-MAP2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-74421 | 1/500 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | warm up to 37 °C before use |
| Paraffin pastilles for histology | Sigma-Aldrich | 1.07164 | Solidification point 56-58°C |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | P6148 | 4% in PBS |
| Penicilin/Streptomycin | Biochrom | A 2213 | penicillin (12U/mL) /streptomycin (12µg/mL) |
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1024 | |
| Rabbit Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1/2000 dilution; incubation period overnight at 4 °C |
| Sodium hydrogen carbonate | Fisher Scientific | S/4240/60 | 2.2g/L |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1126 | 12 mg/Kg |
Referências
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