इंसुलिन का माप- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज चूहों से पृथक और ऊष्मायन परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में अपटेक
Summary
पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक का बरकरार विनियमन महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल इंसुलिन का आकलन प्रस्तुत करता है- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक पृथक और इनक्यूबेटेड परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में जब पूरे शरीर के ग्लूकोज चयापचय पर विभिन्न शारीरिक हस्तक्षेपों के प्रभाव को चित्रित करता है।
Abstract
कंकाल की मांसपेशी एक इंसुलिन-उत्तरदायी ऊतक है और आमतौर पर अधिकांश ग्लूकोज लेती है जो भोजन के बाद रक्त में प्रवेश करती है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि कंकाल की मांसपेशी आराम की स्थिति की तुलना में व्यायाम के दौरान रक्त से ग्लूकोज के निष्कर्षण को 50 गुना तक बढ़ा सकती है। व्यायाम और इंसुलिन उत्तेजना के दौरान मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक में वृद्धि इंट्रासेल्युलर डिब्बों से मांसपेशी कोशिका सतह झिल्ली तक ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GLUT4) के स्थानांतरण पर निर्भर करती है, साथ ही साथ हेक्सोकाइनेज II द्वारा ग्लूकोज -6-फॉस्फेट के लिए ग्लूकोज के फॉस्फोराइलेशन पर निर्भर करती है। अलगाव और माउस की मांसपेशियों का इनक्यूबेशन जैसे कि m. soleus और m. extensor digitorum longus (EDL) परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक पर इंसुलिन और विद्युत-प्रेरित संकुचन (व्यायाम के लिए एक मॉडल) के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पूर्व विवो मॉडल है। इस प्रकार, पूर्व विवो मॉडल मांसपेशियों की इंसुलिन संवेदनशीलता के मूल्यांकन की अनुमति देता है और संकुचन के दौरान मांसपेशियों के बल उत्पादन से मेल खाना संभव बनाता है जो मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप के दौरान मांसपेशियों के तंतुओं की समान भर्ती सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, वर्णित मॉडल औषधीय यौगिक परीक्षण के लिए उपयुक्त है जिसका मांसपेशियों की इंसुलिन संवेदनशीलता पर प्रभाव पड़ सकता है या कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक की नियामक जटिलता को चित्रित करने की कोशिश करते समय मदद मिल सकती है।
यहां हम वर्णन करते हैं और एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं कि कैसे इंसुलिन को मापने के लिए- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को अलग-थलग और इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशियों की तैयारी में चूहों से रेडियोलेबल [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल का उपयोग करके एक एक्स्ट्रासेल्युलर मार्कर के रूप में। यह उलझन कारकों की अनुपस्थिति में परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देता है जो बरकरार पशु मॉडल में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसके अलावा, हम इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशियों की चयापचय व्यवहार्यता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं जो यह सुझाव देते हैं कि लागू की गई विधि में मांसपेशियों की ऊर्जा चयापचय का अध्ययन करते समय कुछ शर्तों के तहत कुछ चेतावनी होती है।
Introduction
कंकाल की मांसपेशी में इंसुलिन और व्यायाम के जवाब में बाहरी स्थान से बड़ी मात्रा में ग्लूकोज निकालने की क्षमता होती है। यह पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में मदद करता है और उच्च ऊर्जा की मांग के समय के दौरान ग्लूकोज की आपूर्ति को सुरक्षित करता है। चूंकि कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक के बरकरार विनियमन को समग्र स्वास्थ्य और शारीरिक प्रदर्शन 1,2 के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है, इसलिए विभिन्न स्थितियों के दौरान मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप पर बहुत ध्यान दिया गया है। मनुष्यों और जानवरों में, हाइपरइन्सुलिनेमिक-यूग्लाइसेमिक क्लैंप का उपयोग विवो 3,4 में इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए सोने की मानक तकनीक के रूप में किया गया है। एक मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण से प्राप्त निष्कर्षों के विपरीत, हाइपरइन्सुलिनेमिक-यूग्लाइसेमिक क्लैंप तकनीक को अग्न्याशय से बरकरार गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फ़ंक्शन या इंसुलिन स्राव की आवश्यकता नहीं होती है और इस प्रकार इंसुलिन प्रतिक्रियाओं को उन विषयों के बीच तुलना करने की अनुमति देता है जो गैस्ट्रो-आंतों और / या अग्नाशय के कार्य में भिन्नता प्रदर्शित करते हैं। मनुष्यों में व्यायाम के दौरान विवो में मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप 1960 के दशक के बाद से अक्सर किए गएहैं। पहले धमनीशिरापरक संतुलन तकनीकों के उपयोग से6 और बाद में पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग के उपयोग से एक पॉज़िट्रॉन उत्सर्जक ग्लूकोज एनालॉग जैसे 18एफ-फ्लोरो-डीऑक्सी-ग्लूकोज7 के साथ संयोजन में। कृन्तकों में, विवो में व्यायाम-प्रेरित मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक आमतौर पर रेडियोधर्मी या स्थिर आइसोटोप-लेबल ग्लूकोज एनालॉग्स 8,9,10 के उपयोग से किया जाता है।
विवो में मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप के लिए एक पूरक विधि, कृन्तकों से छोटी मांसपेशियों को अलग करना और इनक्यूबेट करना है और बाद में रेडियोधर्मी या स्थिर आइसोटोप-लेबल ग्लूकोज एनालॉग्स11,12,13 का उपयोग करके ग्लूकोज अपटेक को मापना है। यह विधि परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक दरों के सटीक और विश्वसनीय परिमाणीकरण की अनुमति देती है और विभिन्न इंसुलिन सांद्रता की उपस्थिति में और विद्युत उत्तेजना द्वारा प्राप्त संकुचन के दौरान की जा सकती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि अलग-थलग और इनक्यूबेटेड कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के माप प्रासंगिक हैं जब चूहों की मांसपेशियों के चयापचय फेनोटाइप की जांच की जाती है जो विभिन्न हस्तक्षेपों (जैसे पोषण, शारीरिक गतिविधि, संक्रमण, चिकित्सीय) से गुजरचुके हैं। पृथक कंकाल मांसपेशी मॉडल भी औषधीय यौगिक परीक्षण के लिए एक उपयुक्त उपकरण है जो प्रति से ग्लूकोज अपटेक को प्रभावित कर सकता है और / या इंसुलिन संवेदनशीलता12,14 को संशोधित कर सकता है। इस तरह, मांसपेशियों के ग्लूकोज चयापचय को विनियमित करने के लिए डिज़ाइन किए गए यौगिकों की प्रभावकारिता का परीक्षण किया जा सकता है और पूर्व-नैदानिक पशु मॉडल में विवो परीक्षण में बाद में होने से पहले एक अत्यधिक नियंत्रित परिवेश में मूल्यांकन किया जा सकता है।
कुछ शर्तों के तहत, चयापचय व्यवहार्यता पृथक और ऊष्मायन कंकाल मांसपेशी मॉडल प्रणाली में एक चुनौती पैदा कर सकती है। दरअसल, इनक्यूबेटेड मांसपेशियों में एक संचार प्रणाली की कमी पर जोर देती है कि सब्सट्रेट (जैसे ऑक्सीजन और पोषक तत्व) का वितरण पूरी तरह से मांसपेशियों के तंतुओं और आसपास के वातावरण के बीच सरल प्रसार पर निर्भर करता है। इसके संबंध में, यह महत्वपूर्ण है कि इनक्यूबेटेड मांसपेशियां छोटी और पतली होती हैं और इस प्रकार,15 इनक्यूबेशन के दौरान ऑक्सीजन प्रसार के लिए एक बाधा का कम प्रतिनिधित्व करती हैं। विशेष रूप से कई घंटों के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन के दौरान, हाइपोक्सिक राज्य अपर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति के कारण विकसित हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों की ऊर्जा में कमीहोती है। यद्यपि इनक्यूबेटेड चूहे की मांसपेशियों में चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों को पहले महत्वपूर्ण चर की पहचान के साथ रिपोर्ट किया गया है जो चूहे की मांसपेशियों की व्यवहार्यता को बनाए रखने में मदद करते हैं15, छोटे इनक्यूबेटेड माउस की मांसपेशियों में चयापचय व्यवहार्यता का एक व्यापक मूल्यांकन अभी भी वारंट किया गया है। इसलिए, वर्तमान में, ग्लाइकोजन सामग्री का उपयोग मुख्य रूप से इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशी16,17 में चयापचय व्यवहार्यता के मार्कर के रूप में किया गया है।
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बेसल, इंसुलिन- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को मापने के लिए अलग-थलग और इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशी में रेडियोलेबल [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल का उपयोग करके चूहों से एक बाहरी मार्कर के रूप में उपयोग करता है। वर्तमान अध्ययन में, ग्लूकोज अपटेक को 10 मिनट की अवधि के दौरान मापा गया था और विधि को उप-अधिकतम और अधिकतम प्रभावी इंसुलिन सांद्रता के साथ-साथ एक एकल संकुचन प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ प्रस्तुत किया गया है। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से इनक्यूबेशन समय, इंसुलिन-खुराक और विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल के संबंध में संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, हम incubated soleus और EDL माउस मांसपेशी में चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों की एक पूरी तरह से लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। परिणामों से संकेत मिलता है कि इनक्यूबेशन बफर के लिए ग्लूकोज पूरकता 1 घंटे के लिए ऊष्मायन की मांसपेशियों की चयापचय व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक का बरकरार विनियमन समग्र स्वास्थ्य1 को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक की जांच अक्सर विभिन्न स्वास्थ्य-परि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को डेनिश काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च – मेडिकल साइंसेज (FSS8020-00288B) और नोवो नॉरडिस्क फाउंडेशन (NNF160C0023046) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को डेनिश मधुमेह अकादमी से रासमस Kjøbsted को एक शोध अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसे नोवो नॉरडिस्क फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, अनुदान संख्या NNF17SA0031406। लेखकों को उनकी कुशल तकनीकी सहायता के लिए करीना ओल्सन, Betina Bolmgren, और Irene Bech Nielsen (पोषण, व्यायाम और खेल विभाग, विज्ञान संकाय, कोपेनहेगन विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| [14C]D-mannitol | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ARC 0127 | |
| [3H]2-deoxy-D-glucose | American Radiolabeled Chemicals, Inc. | ART 0103A | |
| 2-Deoxy-D-glucose | Sigma | D8375 | |
| 4-0 USP non-sterile surgical nylon suture | Harvard Apparatus | 51-7698 | |
| Streptavidin/HRP (Conjugate) | DAKO | P0397 | Used to detect ACC protein |
| Akt2 antibody | Cell Signaling | 3063 | |
| AMPKα2 antibody | Santa Cruz | SC-19131 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6505 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| CaCl2 | Merck | 1020831000 | |
| Calibration kit (force) | Danish Myo Technology A/S | 300041 | |
| Chemiluminescence | Millipore | WBLUF0500 | |
| D-Glucose | Merck | 1084180100 | |
| D-Mannitol | Sigma | M4125 | |
| Data collection program | National Instruments | LabVIEW software version 7.1 | |
| Dialysis tubing | Visking | DTV.12000.09 Size No.9 | |
| Digital imaging system | BioRad | ChemiDoc MP | |
| EDTA | Sigma EDS | E9884 | |
| EGTA | Sigma | E4378 | |
| Electrical Pulse Stimulator | Digitimer | D330 MultiStim System | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| HEPES | Sigma | H7637 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| Insulin | Novo Nordisk | Actrapid, 100 IE/mL | |
| KCl | Merck | 1049361000 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873025 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| MgSO4 | Merck | 1058860500 | |
| Muscle Strip Myograph System | Danish Myo Technology A/S | Model 820MS | |
| Na-Orthovanadate | Sigma | S6508 | |
| Na-Pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Na-Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| NaCl | Merck | 106041000 | |
| NaF | Sigma | S1504 | |
| NaHCO3 | VWR | 27778260 | |
| pACC Ser212 antibody | Cell Signaling | 3661 | |
| pAkt Thr308 antibody | Cell Signaling | 9275 | |
| pAMPK Thr172 antibody | Cell Signaling | 2531 | |
| phenylmethylsulfonylfluoride | Sigma | P7626 | |
| Platinum electrodes | Danish Myo Technology A/S | 300145 | |
| pTBC1D4 Ser588 antibody | Cell Signaling | 8730 | |
| Scintillation counter | Perkin Elmer | Tri-Carb-2910TR | |
| Scintillation fluid | Perkin Elmer | 6013329 | |
| Statistical analyses software | Systat | SigmaPlot version 14 | |
| TBC1D4 antibody | Abcam | ab189890 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| Ultrapure water | Merck | Milli-Q Reference A+ System | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 |
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