Denne protokol præsenterer en metode til måling af adeninnukleotidbinding til receptorer i realtid i et cellulært miljø. Binding måles som Förster-resonansenergioverførsel (FRET) mellem trinitrophenylnukleotidderivater og protein mærket med en ikke-kanonisk, fluorescerende aminosyre.
Vi har udviklet en metode til at måle binding af adeninnukleotider til intakte, funktionelle transmembranreceptorer i et cellulært eller membranmiljø. Denne metode kombinerer ekspression af proteiner mærket med den fluorescerende ikke-kanoniske aminosyre ANAP og FRET mellem ANAP og fluorescerende (trinitrophenyl) nukleotidderivater. Vi præsenterer eksempler på nukleotidbinding til ANAP-mærkede KATP-ionkanaler målt i udækkede plasmamembraner og udskårne, indefra og ud membranpletter under spændingsklemme. Sidstnævnte muliggør samtidige målinger af ligandbinding og kanalstrøm, en direkte aflæsning af proteinfunktionen. Databehandling og analyse diskuteres udførligt sammen med potentielle faldgruber og artefakter. Denne metode giver rig mekanistisk indsigt i den ligandafhængige gating af KATP-kanaler og kan let tilpasses undersøgelsen af andre nukleotidregulerede proteiner eller enhver receptor, for hvilken en passende fluorescerende ligand kan identificeres.
Flere vigtige klasser af protein reguleres direkte af ligandbinding. Disse spænder fra opløselige enzymer til membranindlejrede proteiner, herunder receptortyrosinkinaser, G-proteinkoblede receptorer (GPCR’er) og ionkanaler. GPCR’er og kanaler tegner sig for ~ 34% og ~ 15% af alle nuværende lægemiddelmål, henholdsvis 1,2. Derfor er der en betydelig biokemisk såvel som medicinsk interesse i at udvikle metoder, der giver mekanistisk indsigt i ligand-receptorinteraktioner. Traditionelle metoder til måling af ligandbinding, herunder fotoaffinitetsmærkning og radioligandbindingsundersøgelser, kræver store mængder delvist oprenset protein og udføres typisk under ikke-fysiologiske forhold og tidsskalaer. En ideel metode ville kun kræve små mængder protein, kunne udføres på intakte proteiner udtrykt i et cellulært eller membranmiljø, kunne overvåges i realtid og ville være kompatibel med direkte aflæsninger af proteinfunktionen.
Förster resonans energy transfer (FRET) er en metode, der detekterer nærheden mellem to fluorescerende mærkede molekyler3. FRET opstår, når en exciteret donorfluorofor overfører energi på en ikke-strålingsmæssig måde til et acceptormolekyle (typisk en anden fluorofor). Energioverførsel resulterer i slukning af donorfluorescensemissionen og sensibilisering af acceptoremissionen (hvis acceptoren er en fluorofor). Overførselseffektiviteten afhænger af den 6. effekt af afstanden mellem donor og acceptor. Desuden skal donor og acceptor være i nærheden (normalt mindre end 10 nm), for at FRET kan forekomme. Som sådan kan FRET udnyttes til at måle den direkte binding mellem en fluorescerende mærket proteinreceptor og en fluorescerende ligand.
Flere forskellige proteiner reguleres eller aktiveres ved binding af intracellulære eller ekstracellulære adeninnukleotider (ATP, ADP, AMP, cAMP). Mange transportørproteiner kræver ATP-hydrolyse til deres reaktionscyklus, herunder ATP-bindende kassettetransportører og P-type ATPaser som Na+/K+-pumpen 4,5. ATP-følsomme K + (K ATP) kanaler, cystisk fibrose transmembran konduktansregulator (CFTR) og cyklisk-nukleotidregulerede kanaler er alle ionkanaler, der er lukket ved binding af intracellulære adeninnukleotider, hvilket gør dem udsøgt følsomme over for ændringer i cellulær metabolisme og signaltransduktion 6,7,8 . Purinerge P2X- og P2Y-receptorer reagerer på ændringer i ekstracellulær ATP, som kan frigives som en neurotransmitter eller som følge af vævsskade9. Vi har udviklet et FRET-baseret assay til måling af adeninnukleotidbinding til membranproteiner i realtid. Vi har tidligere anvendt denne metode til at studere nukleotidbinding til K ATP-kanaler 10,11.
For at måle nukleotidbinding via FRET skal et protein af interesse først mærkes med en fluorofor. Det fluorescerende mærke skal indsættes stedspecifikt i det pågældende protein, således at det er tæt nok på ligandbindingsstedet til, at FRET kan forekomme, idet der lægges særlig vægt på at sikre, at mærket ikke påvirker proteinets overordnede struktur og funktion. For at opnå dette anvender vi en teknik udviklet af Chatterjee et al., ved hjælp af rav stop-codon undertrykkelse til at indsætte en fluorescerende ikke-kanonisk aminosyre (l-3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropionisk; ANAP) på det ønskede sted12. Vi måler nukleotidbinding som FRET mellem ANAP-mærket protein og fluorescerende, trinitrophenyl (TNP) nukleotidderivater (figur 1A). Emissionsspektret for ANAP overlapper absorbansspektret for TNP-nukleotider, en betingelse for, at FRET kan forekomme (figur 1B). Her skitserer vi to forskellige typer bindingseksperiment. I den første måles nukleotidbinding til den intracellulære side af ANAP-mærkede KATP-kanaler i celler, der er blevet afdækket af sonikering, hvilket efterlader klæbende fragmenter af plasmamembran på et glasdækselslip 10,11,13,14.
I den anden metode måles nukleotidbinding til ANAP-mærkede KATP-kanaler i et membranplaster under spændingsklemme, hvilket muliggør samtidig måling af ionstrømme og fluorescens. Ved at kombinere disse to eksperimentelle tilgange kan ændringer i binding korreleres direkte med ændringer i kanalfunktion11. Typiske resultater, potentielle faldgruber og dataanalyse diskuteres.
Vi har udviklet en metode til at måle adeninnukleotidbinding i realtid til intakte membranproteiner. Vores metode bygger på flere andre etablerede teknikker, herunder mærkning af proteiner med ANAP ved hjælp af ravstopkodonundertrykkelse 12, celleafdækning 14 og spændingsklemmefluorometri / PCF 19,20,21,22,23,24,25 . Syntesen af disse tilgange muliggør måling af nukleotidbinding med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. Faktisk var vi i vores tidligere arbejde i stand til at skelne mellem forskellige bindingssteder på det samme proteinkompleks ved hjælp af denne tilgang10,11. Det er vigtigt, at denne teknik kan anvendes direkte på små mængder protein i et cellulært miljø under forhold, der bevarer proteinfunktionen. Ved hjælp af vores bindingsmetode sammen med direkte, elektrofysiologisk aflæsning af ionkanalstrømme kan vi få rig indsigt i det molekylære grundlag for kanalgating11.
Da spektrometre er et ikke-standardiseret stykke laboratorieudstyr, kan ANAP-intensiteten også overvåges relativt isoleret ved hjælp af båndpasfiltre. Figur 5B viser spektrale egenskaber af to sådanne filtre. 470/10 nm båndpasfilteret screener effektivt fluorescenssignalet fra TNP-ATP og overlapper godt med peak ANAP-fluorescensen. Imidlertid er toptransmissionen for dette filter kun omkring 50%, hvilket kan gøre det vanskeligt at opnå gode signaler fra svage membraner (eller i udskårne membranpletter under spændingsklemme). En anden mulighed er et 460/60 nm båndpasfilter. Der er lidt mere overlapning mellem 460/60 nm-filteret og foden af TNP-ATP-emissionstoppen sammenlignet med 470/10 nm-filteret. Imidlertid har 460/60 nm båndpasset en transmission på 90-95% over et bredt område af ANAP-toppen, hvilket forventes at øge fluorescensemissionssignalet.
ANAP er en miljøfølsom fluorofor 12,26,27. Topemissionen og kvanteudbyttet varierer afhængigt af inkorporeringsstedet på proteinet af interesse og kan ændre sig, efterhånden som proteinet ændrer konformation. Sådanne ændringer ville være umiddelbart tydelige ud fra emissionsspektre, men ville ikke være så indlysende, når ANAP-intensiteten måles ved hjælp af filtre. Under alle omstændigheder kræves passende kontroller for at påvise, at fluorescenssignalet ikke varierer på grund af ændringer i det lokale miljø omkring ANAP efter nukleotidbindingen. Kontroleksperimenter med umærkede nukleotider kan hjælpe med at verificere, at eventuelle ændringer i ANAP-intensitet er resultatet af FRET mellem ANAP og TNP-nukleotider. TNP-nukleotider kan binde uspecifikt til membranerne afledt af utransfekterede celler (enten til plasmamembranen eller til native membranproteiner)10. Vi kvantificerer binding som et fald i donorfluorescensen, da dette signal er specifikt for den mærkede kanal. Vi anbefaler dog at udføre yderligere kontrolforsøg for hvert agonist/receptorpar, for eksempel mutering af nukleotidbindingsstedet, hvis det er kendt, for at verificere, at ændringen i donorfluorescens virkelig er resultatet af direkte binding til den mærkede receptor11. Endelig anbefales det at arbejde med konstruktioner, der indeholder et fluorescerende proteinmærke ud over ANAP-mærket. Dette hjælper med at differentiere mærket receptorfluorescens fra baggrund / autofluorescens. Baggrundsfluorescens kan skelnes fra ANAP ved toppen og formen af emissionsspektre10, men sådanne bestemmelser kan være meget vanskelige, når der kun anvendes filtersæt. Derudover kan celler og udækkede membraner, der udtrykker fluorescerende receptorer, identificeres ved hjælp af fluorescerende proteinmærke uden at skulle excitere ANAP og risikere overdreven fotoblegning.
I mange af vores PCF-optegnelser observerede vi en stærk negativ top i vores spektre ved høje TNP-ATP-koncentrationer (figur 4C). Denne negative top er en artefakt af vores baggrundssubtraktionsprotokol. Figur 4D viser lysfeltsbilleder og fluorescerende billeder af en plasterpipette udsat for 1 mM TNP-ATP. Der er tydelig en skygge ved pipettespidsen, som skyldes udelukkelse af TNP-ATP fra pipettevæggenes volumen, hvilket er mest tydeligt inden for fokusplanet. Spektralbilledet i figur 4E viser et mørkt bånd, der svarer til denne skygge. Når et område over eller under dette mørke bånd bruges til baggrundssubtraktion, producerer det en negativ top. Det er vigtigt, at denne top fandt sted over et bølgelængdeområde svarende til TNP-ATP-emission og påvirkede ikke vores målinger af ANAP-slukning.
Den største begrænsning af vores eksperimenter var at opnå tilstrækkelig plasmamembranekspression af ANAP-mærkede konstruktioner til måling af fluorescens. Det var generelt lettere at erhverve spektre af høj kvalitet fra udækkede membraner end i PCF på grund af deres større størrelse og vores evne til hurtigt at scanne en hel skål med udækkede membraner, i modsætning til PCF, hvor patches kun kan fås en ad gangen. I vores eksperimenter var dataene fra membraner uden tag og PCF-eksperimenter ens, men ikke ækvivalente (figur 6)11. Der er dog ingen a priori grund til, at dette skulle være en universel observation, da proteiner i en plasterpipette kan være i en anden funktionel tilstand end dem i membraner uden tag.
Her er der gjort forsøg på at maksimere ekspressionen af vores ANAP-mærkede konstruktioner, især sænke cellekulturtemperaturen til 33 °C10,11,16. Efter vores erfaring resulterede forsøg på at identificere steder i proteinet, hvor ANAP ville være en konservativ substitution, ikke konsekvent i konstruktioner, der udtrykte sig godt. Vi havde større succes med systematisk at scanne hele proteinområder for ANAP-inkorporeringssteder og screene kandidater for overfladeekspression10. ANAP-mærkningssystemet fungerer også i Xenopus laevis oocytter, hvilket gør det muligt at udskære meget større membranplastre, hvilket øger signalet til støj26,27,28.
Mens større ekspressionsniveauer forventes at resultere i lysere signaler, afhænger det mindste antal kanaler, der kræves for at måle fluorescens, af flere faktorer, herunder fluoroforens lysstyrke, graden af fotoblegning, intensiteten af excitationslyset og fokusplanet. I teorien kunne estimater foretages ved at korrelere fluorescensintensiteten og kanalstrømmen, som tidligere har vist28,29. Pålideligheden af sådanne estimater kræver imidlertid et vist kendskab til enkeltkanalens konduktans og kanalens åbne sandsynlighed. Ud over de faktorer, der er anført ovenfor, vil fluorescenssignalet også blive påvirket af kanaler forbundet med vesikler eller sektioner af plasmamembranen, der sidder fast på pipetteglasset, der ikke er under spændingsklemme.
Denne metode er let tilpasset undersøgelsen af andre nukleotidfølsomme ionkanaler. CFTR svarer strukturelt til tilbehørssulfonylurinstofreceptorunderenheden af KATP30,31. Ligesom KATP CFTR styres gating af nukleotidbinding, hvilket gør det til et oplagt fremtidigt mål for vores metode7. Purinerge P2X-receptorer er ionkanaler gated af ekstracellulær ATP9. TNP-ATP virker som en antagonist for P2X-receptorer32,33. Derfor vil det ikke være nyttigt at studere P2X-aktivering, selvom det kan bruges i konkurrenceanalyser med P2X-agonister. Alternativt kan andre fluorescerende ATP-derivater med tilstrækkelig spektral overlapning med ANAP-emission anvendes til at undersøge aktivering. Alexa-647-ATP er en fluorescerende P2X-agonist34. Den beregnede R0 mellem Alexa-647 og ANAP er ~85 Å, hvilket betyder, at direkte binding til P2X skulle resultere i betydelig slukning af ANAP inkorporeret i kanalen. Imidlertid vil en så lang R0 også resultere i slukning fra Alexa-647-ATP bundet til nærliggende underenheder og øger sandsynligheden for, at ikke-specifik nukleotidbinding vil resultere i FRET. Da ligandbindingsstedet i P2X-receptorer er ekstracellulært, vil bindingsmålinger blive udført på intakte celler, i helcellespændingsklemme eller i udefrakommende membranplastre. Vores metode kan også udvides til at studere binding og aktivering af elektrogene og ikke-elektrogene transportører og pumper, der er afhængige af ATP for deres reaktionscyklus samt G-proteinkoblede P2Y-receptorer. Endelig, selvom vi har udviklet denne metode til måling af adeninnukleotidbinding (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), kan den samme tilgang bruges til at studere binding til stort set enhver receptor, for hvilken en passende, fluorescerende ligand er blevet identificeret.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Raul Terron Exposito for fremragende teknisk assistance. Dette arbejde blev finansieret af Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/R002517/1; MCP og FMA) og Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)
T75 tissue-culture treated flask | StarLab | CC7682-4875 | |
0.1% w/v poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
30 mm borosilicate cover glass slips | VWR | 631-0174 | |
35 mm non-treated sterile dishes | CytoOne | CC7672-3340 | |
35 mm cover glass bottom dish | WPI | FD35-PDL-100 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 31966021 | |
Foetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500-064 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
TrypLE select (tryosin) | Gibco | 12563-011 | Trypsin/EDTA reagent |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14040-091 | |
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977-035 | |
HEK293T cells | ATTC | CRL-3216 | Used between passages 5-30 |
ANAP-TFA | AsisChem | ASIS-0014 | Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM |
pANAP expression plasmid | Addgene | Plasmid #48696 | Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein |
peRF1-E55D | Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK) | Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728 | Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor |
TransIT-LT1 | Mirus Bio | MIR 2300 | Lipopolyplex transfection reagent |
Thick-walled borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | GC150F-15 | |
Tetramethylrhodamine-5-maleimide | Sigma-Aldrich | 94506 | |
TNP-ATP | Jena Bioscience | NU-221L | Delivered at 10 mM in water |
Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope | Nikon | ||
60x water immersion objective (1.4 NA) | Nikon | MRD07602 | |
4-Wavelength High-Power LED Head | ThorLabs | LED4D245 | 385/490/565/625 nm LEDs |
Four-Channel LED Driver | ThorLabs | DC4100 | |
390/18 nm band-pass excitation filter | ThorLabs | MF390-18 | For ANAP excitation |
400 nm long-pass emission filter | ThorLabs | FEL0400 | For imaging ANAP spectra |
416 nm edge dichroic | ThorLabs | MD416 | For imaging ANAP spectra |
460/60 nm band-pass emission filter | ThorLabs | MF460-60 | Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
470/10 nm band-pass emission filter | ThorLabs | FB470-10 | Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B) |
531/40 band-pass excitation filter | Brightline | FF01-531/40-25 | For orange fluorescent protein (OFP) excitation |
540/25 nm band-pass excitation filter | Chroma | D540/25X | For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation |
562 nm edge dichroic | Semrock | FF562-Di03 | For imaging OFP fluorescence |
565 nm edge dichroic | Chroma | 565DC | For imaging TMRM fluorescence |
593/40 nm band-pass excitation filter | Brightline | FF01-387/11-25 | For imaging OFP fluorescence |
605/55 nm band-pass emission filter | Chroma | D605/55M | For imaging TMRM fluorescence |
IsoPlane-160 Imaging Spectrometer | Princeton Instruments | IsoPlane-160 | |
PIXIS 400BR_eXcelon Camera | Princeton Instruments | PIXIS: 400BR_eXcelon | |
Axopatch 200B amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B-2 | |
Digidata 1440A digitizer | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
Probe sonicator | Sonics & Materials | VC-50 | For unroofing |
REGLO digital peristaltic pump | Ismatec | ISM 832 | For bath perfusion |
Microvolume perfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA μFlow-8 | For TNP-ATP perfusion |
pClamp 10.6.2 | Molecular Devices | Recording and analysing currents | |
Lightfield 5.20.1507 | Princeton Instruments | Acquisition software for images and spectra | |
Matlab | Mathworks | For data analysis | |
Python 3.8.1 | Python Software Foundation | For data analysis |