वयस्क प्रेयरी वोल्स में न्यूरोजेनिक निकस से प्राप्त न्यूरोस्फीयर की संस्कृति
Summary
हमने विट्रो अध्ययन में पूरक के रूप में, प्रेयर वोल्स के वयस्क मस्तिष्क के सबवेंट्रिकर जोन और डेंटेट जाइरस से तंत्रिका जनक कोशिकाओं को संस्कृति करने की शर्तों की स्थापना की, जो सामाजिक व्यवहार से जुड़े कार्यात्मक प्लास्टिक परिवर्तनों का हिस्सा हो सकता है।
Abstract
न्यूरोस्फेयर प्राथमिक कोशिका समुच्चय हैं जिनमें तंत्रिका स्टेम सेल और जनक कोशिकाएं शामिल हैं। ये 3 डी संरचनाएं तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और प्रसार क्षमता को निर्धारित करने के साथ-साथ समय के साथ परख की तुलना में सेल लाइनों को उत्पन्न करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण हैं। इसके अलावा, न्यूरोस्फीयर एक आला (इन विट्रो) बना सकते हैं जो गतिशील बदलते वातावरण के मॉडलिंग की अनुमति देता है, जैसे कि विकास कारक, हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, दूसरों के बीच अलग-अलग। माइक्रोटस ओकारोगस्टर (प्रेयर वोल्) सामाजिक-यौन व्यवहार और सामाजिक अनुभूति के न्यूरोबायोलॉजिकल आधार को समझने के लिए एक अनूठा मॉडल है। हालांकि, इन व्यवहारों में शामिल सेलुलर तंत्र अच्छी तरह से ज्ञात नहीं हैं। प्रोटोकॉल का उद्देश्य वयस्क प्रेयर वोल के न्यूरोजेनिक निकस से तंत्रिका जनक कोशिकाओं को प्राप्त करना है, जो गैर-अनुयायी परिस्थितियों में सुसंस्कृत होते हैं, न्यूरोस्फीयर उत्पन्न करने के लिए। न्यूरोस्फीयर का आकार और संख्या प्रेयर वोल के क्षेत्र (सबवेंट्रिकुलर जोन या डेंटेट जायरस) और सेक्स पर निर्भर करती है। यह विधि विट्रो में न्यूरोजेनिक निकस में सेक्स-निर्भर मतभेदों का अध्ययन करने के लिए एक उल्लेखनीय उपकरण है और पेयर बॉन्डिंग और बाइपेरेंटल केयर जैसे सामाजिक व्यवहारों से जुड़े न्यूरोप्लास्टिसिटी परिवर्तन। इसके अलावा, संज्ञानात्मक स्थितियों है कि सामाजिक बातचीत (आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकारों और पागलपन) में घाटे आवश्यक जांच की जा सकती है ।
Introduction
प्रेयर वोल(माइक्रोटस ओगरोगेस्टर),क्रिसेटिडी परिवार का एक सदस्य, एक छोटा स्तनपायी है जिसकी जीवन रणनीति सामाजिक रूप से एकयुग्मी और अत्यधिक मिलनसार प्रजातियों के रूप में विकसित होती है। नर और मादा दोनों ही घोंसला साझा करने, अपने क्षेत्र की रक्षा करने औरअपनी संतान1, 2, 3, 4के लिए द्विपरेंटल देखभाल प्रदर्शित करने के लिए सहवास की लंबी अवधि के बाद एक स्थायी जोड़ी बंधनस्थापितकरते हैं। इस प्रकार, प्रेयर वोल् सामाजिक-यौन व्यवहार और सामाजिक अनुभूति में हानि के न्यूरोबायोलॉजिकल आधार को समझने के लिए एक मूल्यवान मॉडल है5.
वयस्क न्यूरोजेनेसिस तंत्रिका प्लास्टिसिटी की सबसे सर्वोपरि प्रक्रियाओं में से एक है जो व्यवहार में परिवर्तन की ओर जाता है। उदाहरण के लिए, हमारे अनुसंधान समूह ने पुरुष वोल्स में बताया कि हिप्पोकैम्पस के डेंटेट जायरस (डीजी) में सबवेंट्रिकुलर जोन (वीजेड) और उपग्रानीय क्षेत्र में संभोग वृद्धि सेल प्रसार के साथ सामाजिक सहवास, सुझाव है कि वयस्क न्यूरोजेनेसिस प्रेयर voles (अप्रकाशित डेटा) में संभोग द्वारा प्रेरित जोड़ी संबंध के गठन में एक भूमिका निभा सकते हैं । दूसरी ओर, यद्यपि मस्तिष्क क्षेत्र जहां नए न्यूरॉन्स उत्पन्न और एकीकृत होते हैं, वे सर्वविदित होते हैं, इन प्रक्रियाओं में शामिल आणविक और सेलुलर तंत्र पूरे मस्तिष्क मॉडल6में तकनीकी कमियों के कारण अनिर्धारित रहते हैं। उदाहरण के लिए, जीन अभिव्यक्ति और अन्य सेलुलर गतिविधियों को नियंत्रित करने वाले सिग्नलिंग पाथवे में अपेक्षाकृत कम सक्रियण अवधि (फॉस्फोप्रोटेम का पतालगाना) 7है। एक वैकल्पिक मॉडल वयस्क न्यूरोजेनेसिस में शामिल आणविक घटकों को स्पष्ट करने के लिए अलग और सुसंस्कृत वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं या जनक कोशिकाओं है।
वयस्क स्तनपायी (माउस) मस्तिष्क से विट्रो तंत्रिका अग्रदूतों को बनाए रखने के लिए पहला दृष्टिकोण न्यूरोस्फीयर की परख थी, जो गैर-अनुयायी परिस्थितियों में बढ़ रही सेलुलर समुच्चय हैं जो न्यूरॉन्स उत्पन्न करने के लिए अपनी बहुपंतक क्षमता को संरक्षित करते हैं, साथ ही एस्ट्रोसाइट्स8,9,10। उनके विकास के दौरान, एक चयन प्रक्रिया है जहां केवल अग्रदूत ही8,9,10को पैदा करने और न्यूरोस्फेयर उत्पन्न करने के लिए एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर 2 (एफजीएफ2) जैसे माइटोजेन्स का जवाब देंगे।
हमारी जानकारी के लिए, प्रेयर voles से वयस्क तंत्रिका जनक प्राप्त करने के लिए साहित्य में कोई प्रोटोकॉल की सूचना दी है। यहां, हमने न्यूरोजेनिक निकस और न्यूरोस्फीयर गठन परख के माध्यम से उनके इन विट्रो रखरखाव से न्यूरोनल प्रोजेनिटर को अलग करने के लिए संस्कृति की स्थिति स्थापित की। इस प्रकार, प्रयोगों को आणविक और सेलुलर तंत्र की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है जो तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और जनकों के प्रसार, प्रवासन, भेदभाव और अस्तित्व में शामिल हैं, ऐसी प्रक्रियाएं जो अभी भी प्रेयर वोल में अज्ञात हैं। इसके अलावा, वीजेड और डीजी से प्राप्त कोशिकाओं के गुणों में विट्रो मतभेदों को स्पष्ट करने से सामाजिक-यौन व्यवहार और संज्ञानात्मक व्यवहारों में परिवर्तन से जुड़े तंत्रिका प्लास्टिसिटी में न्यूरोजेनिक निकस की भूमिका के बारे में जानकारी मिल सकती है, और सामाजिक बातचीत (आत्मकेंद्रित स्पेक्ट्रम विकार और सिजोफ्रेनिया) में घाटा हो सकता है, जो सेक्स-निर्भर भी हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
तंत्रिका स्टेम सेल संस्कृति प्राप्त करने के लिए एक चरण एंजाइमेटिक समाधान के साथ पाचन अवधि है, जो 30 मिनट से अधिक नहीं होनी चाहिए क्योंकि यह सेल व्यवहार्यता को कम कर सकता है। प्रारंभिक संस्कृति के बाद 8-10 द…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को अनुदान CONACYT 252756 और 253631 द्वारा समर्थित किया गया था; यूएनएम-डीजीपा-पपिट IN202818 और IN203518; INPER 2018-1-163, और NIH P51OD11132। हम डेसी गैस्का, कार्लोस लोजानो, मार्टिन गार्सिया, एलेजैंड्रा कैस्टिला, निडिया हर्नांडेज, जेसिका नॉरिस और सुजाना कास्त्रो को उनकी उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
Referências
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