Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten
Summary
Dreidimensionale (3D) zelluläre Systeme sind relevante Modelle zur Untersuchung der Organogenese. Eine hydrogelbasierte Methode für die Produktion von Gallenzysten und deren Charakterisierung wird vorgeschlagen. Dieses Protokoll entschlüsselt die Barrieren der 3D-Charakterisierung, mit einer einfachen und zuverlässigen Methode, um die Effizienz der Zystenbildung und ihre Funktionalität zu bewerten.
Abstract
Cholangiozyten, die Epithelzellen, die die Gallengänge in der Leber aneinanderreihen, bewachen die Gallenbildung und -modifikation. In den letzten zwanzig Jahren sind im Zusammenhang mit Lebererkrankungen dreidimensionale (3D) Modelle entstanden, die auf Cholangiozyten basieren, wie Zysten, Sphäroide oder röhrenartige Strukturen, um Gewebetopologie für Organogenese, Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening-Studien nachzuahmen. Diese Strukturen wurden hauptsächlich durch Einbettung von Cholangiozyten in ein Hydrogel gewonnen. Der Hauptzweck bestand darin, die Selbstorganisation zu untersuchen, indem epitheliale Polarität, funktionelle und morphologische Eigenschaften angegangen wurden. Jedoch, nur sehr wenige Studien konzentrieren sich auf Zystenbildung Effizienz. Wenn dies der Fall ist, wird die Effizienz oft anhand von Bildern einer einzelnen Ebene quantifiziert. Funktionelle Assays und Strukturanalysen werden durchgeführt, ohne die potenzielle Heterogenität der Zystenverteilung darzustellen, die sich aus Hydrogelpolymerisationsheterogenitäten und Nebenwirkungen ergibt. Daher kann die quantitative Analyse, wenn sie durchgeführt wird, nicht für den Vergleich von einem Artikel zum anderen verwendet werden. Darüber hinaus erlaubt diese Methode keine Vergleiche des 3D-Wachstumspotenzials verschiedener Matrizen und Zelltypen. Darüber hinaus wird die experimentelle Fehlerbehebung für immunstainierende Zysten nicht erwähnt. In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige und universelle Methode, um zu zeigen, dass die anfängliche Zellverteilung mit der heterogenen vertikalen Verteilung der Zystenbildung zusammenhängt. Cholangiozytenzellen, die in Hydrogel eingebettet sind, werden mit Z-Stacks-Analysen entlang der Hydrogeltiefe im Laufe von 10 Tagen verfolgt. Mit dieser Methode wird eine robuste Kinetik der Zystenbildung Effizienz und Wachstum erhalten. Wir präsentieren auch Methoden zur Bewertung der Zystenpolarität und der Sekretorialfunktion. Schließlich werden zusätzliche Tipps zur Optimierung von Immunstaining-Protokollen zur Verfügung gestellt, um den Zystenkollaps für die Bildgebung zu begrenzen. Dieser Ansatz kann auf andere 3D-Zellkulturstudien angewendet werden, wodurch die Möglichkeiten eröffnet werden, ein System mit einem anderen zu vergleichen.
Introduction
In den letzten drei Jahrzehnten hat sich der Bereich der In-vitro-Forschung zu 3D-Kultursystemen entwickelt. Eine Reihe von Protokollen sind für die Kultivierung von Zellen in 3D als Sphäroide oder Aggregate in Gegenwart oder Abwesenheit eines Gerüstes/Matrix, in einem Tropfen, in Deragitation, in mikrofluidischen Geräten oder schwimmend1entstanden. Die Verwendung von 3D-Kulturmethoden hat sich gegenüber 2-dimensionalen (2D) Kulturen bewährt, insbesondere bei Epithelzellen, die sich nachweislich in 3D-Strukturen, zysten oder acini, selbst organisieren. In diesem Fall bilden die Zellen eine Monoschicht, die ein Lumen umgibt, wo Zellen ihren vollen epitheliaalen Phänotyp mit verbesserten physiologischen spezifischen Funktionen erwerben2.
Zahlreiche Studien haben zur Entwicklung von Methoden zur Bildung dieser epitheliale Organoide in natürlichen Matrizen beigetragen. Dies hat es ermöglicht, in vivo Zell-Zell- und Zell-Mikroumgebung-Wechselwirkungen zu rekapitulieren, um die Etablierung und Stabilität des epithelialen Phänotyps3,4,5,6,7zu erhalten. Kürzlich, insbesondere mit dem Ziel, transplantierbare Organoide zu entwickeln und die Anforderung der Mikroumgebung für die Orchestrierung des Epithelprogramms zu entschlüsseln, wurden synthetische Hydrogele entwickelt, um die Bildung von epithelialen Acini8,9,10zu verbessern. Leider berichten diese Studien über qualitative Daten oder präsentieren Berechnungsmethoden mit internen Referenzen wie das Verhältnis von Zysten zu Nichtzysten in einer 2D-Ebene8,9,10. Dies schließt einen Vergleich zwischen verschiedenen Studien in Bezug auf Effizienz, Stabilität oder morphologische und physiologische Charakterisierung der Epithelorganoide aus.
Die Mikroverkapselung von Epithelzellen in Perlen mit mikrofluidischen Geräten hat realistischere quantitative und vergleichende Ergebnisse ermöglicht. Mit dieser Technologie wurden Organoide aus verschiedenen Zelltypen gebildet und anhand der Morphologie zwischen verschiedenen 3D-Zellstrukturen11,12unterschieden. Diese Technologie ist jedoch nicht einfach zu bedienen und erfordert die Verwendung von Reinräumen, um die mikrofluidischen Geräte herzustellen. Diese Technologie wurde für einige Arten von Hydrogelen etabliert, erfordert aber technische Anpassungen, um auf andere Hydrogele angewendet zu werden, was ihre Vielseitigkeit einschränkt. Daher basieren die meisten Studien, die epitheliale Organoide entwickeln sollen, auf der Einbettung von Epithelzellen in eine Hydrogelmasse. Bei diesen Methoden wird die hohe Heterogenität der Gelstrukturierung und Zellverteilung innerhalb der gesamten 3D-Kultur oft vernachlässigt. Daher beziehen sich die meisten Analysen auf einzelne 2D-Bilder, die nur sehr grob die Verteilung der verschiedenen zellulären Objekte im gesamten 3D-Volumen darstellen.
Krankheiten, die Gallengänge beeinflussen, wie Cholangiokarzinom, Gallenatresie, primäre sklerosierende Cholangitis, unter anderem, sind eine der Hauptursachen für Sterblichkeit und Morbidität. Mit Ausnahme der Lebertransplantation gibt es keine wirksamen Behandlungen für diese Bedingungen13. Bemühungen zur Untersuchung der Gallengangbildung, der Krankheitsursachen und des Fortschreitens werden die Entwicklung neuartiger Therapien ermöglichen14.
Biliäre organotypische Modelle von Zysten, Sphäroiden oder röhrenähnlichen Strukturen mit normalen oder patientenabgeleiteten, differenzierten oder von Vorläufern abgeleiteten Cholangiozytenzelllinien wurden15,16,17,18,19,20entwickelt. Verschiedene Studien haben cholangiozyte Polarität, Expression von Cholangiozytenmarkern, Vorhandensein von Zilien, Cholangiocyte sekretot und reabsortive Fähigkeit, und Lumenbildung und Obstruktion rekapituliert; alle stellen wichtige Merkmale des Cholangiocyten-Phänotyps, der Morphologie und der Funktion15,17,19dar. Andere haben berichtet, dass die Aufrechterhaltung von patientenabgeleiteten Gallenorganoiden über einen längeren Zeitraum20berichtet hat. Kürzlich haben wir die Rolle biochemischer und biophysikalischer Hinweise auf gallenzysische Organogeneseuntersucht 21. Wichtig ist, dass die Pathogenese der Gallenatresie in Gallensphäriden und Röhren untersucht wurde7,22. Darüber hinaus wurden Schlüsselmerkmale der primären sklerosierenden Cholangitis wie Cholangiozytenszenz, Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen sowie Makrophagenrekrutierung erfolgreich mit Gallensphäriden15,20untersucht. Reproduzierbare in vitro 3D-quantitative Modelle, die physiologisch modulierencholangioyten Phänotyp, Physiologie und Mikroumgebung, in denen diese Fragen behandelt werden können, sind jedoch noch erforderlich. Darüber hinaus haben nur wenige Veröffentlichungen zystenbildung Effizienzberichtet 21,23. Dies ist ein wichtiger Punkt, um festzustellen, vor allem bei der Untersuchung der Organogenese, Krankheitsursache, und Korrelation der Arzneimittelreaktionen mit Cholangigiocyte Funktion und Polarisation. Darüber hinaus ist es schwierig, mit Unterschieden in Gerüst/Matrix, die von Protokoll zu Protokoll verwendet werden, zwischen Systemen zu vergleichen. Um diese Probleme zu lösen, schlagen wir eine quantitative, zuverlässige und universelle Methode vor, um Gallenzysten zu erzeugen, die Lumenbildung, Cholangiozytenpolarisation und Cholangiozytensekretoriennachlungimitat imitieren. Wichtig ist, dass wir eine systematische Analyse entlang der Z-Achse über das 3D-Gel hinweg präsentieren, wenn wir die Effizienz der Zystenbildung, Größe, Lebensfähigkeit, Polarisation und Funktionalität im Zeitverlauf bewerten. Darüber hinaus verwendeten wir ein natürliches Hydrogel und normale Rattencholangiocyten (NRC)s, als Beispiel für das Protokoll, aber andere natürliche oder synthetische Hydrogele, sowie Epithelzellen könnten für die Bildung von 3D-zystischen Strukturen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die Organogenese und die Erhaltung von 3D-Zellstrukturen zu untersuchen, wurden verschiedene Gewebe modelliert, mit unterschiedlichen zellulären Ursprüngen, aber auch verschiedenen Arten von extrazellulären Matrizen einschließlich synthetischer Hydrogele8,9,10,21. Aufgrund des Fehlens einer quantitativen 3D-Analyse, die Vergleiche zwischen Methoden in Bezug auf Organoidbildung oder Funkt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Vereinigte Staaten), der freundlicherweise die NRC-Zelllinie zur Verfügung gestellt hat.
Diese Arbeit wurde sowohl vom iLite RHU-Programm (Grant ANR-16-RHUS-0005) als auch von der DHU Hepatinov finanziell unterstützt.
Wir danken Isabelle Garcin und Réseau d’Imagerie Cellulaire Paris Saclay für ihre Unterstützung bei der Bildgebung.
Materials
| 10 µl- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 µl – Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC complete medium final concentration = 3.4 µg/mL |
| Acetic acid | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Aerosol barrier pipettes tips 10 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 1000 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Aerosol barrier pipettes tips 200 µl (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Antibiotic Antimicotic Solution (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Bovine pituitary extract | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC complete medium final concentration = 30 µg/mL |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | 1:1000 dilution |
| Chemically Defined Lipid Concentrate (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Collagen high concentration, rat tail | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µg/mL final concentration |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC complete medium final concentration = 0.393 µg/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC complete medium final concentration = 1X |
| E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | 1:400 dilution |
| Eclipse TE300 inverted microscope | Nikon | imaging | |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0.32 mM |
| Fetal calf serum | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution |
| Fluoroshield with DAPI (Mounting medium) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldehyde 16% (W/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4% (W/V) |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA – flash 4.OLT) | Hamamatsu | imaging | |
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µg/mL final concentration |
| IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | 1:500 dilution |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Open source image processing software | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | 4:10 dilution |
| NIS Elements software version 4.50.00 | Nikon | image acquisition and display | |
| Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (∞/1.2 WD 15.2) | Nikon | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µg/mL final concentration |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16.2 nM final concentration |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µM final concentration |
| Soybean trypsin inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complete medium final concentration = 50 µg/mL |
| Sterile cell strainer 40 µm (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | 5:100 dilution |
| Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | 5:10000 dilution |
| Vitamin (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution |
| μ-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
Referências
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