Dit protocol maakt de bereiding van dwarse delen van graanzaden (bijv. Rijst) mogelijk voor de analyse van endosperm en zetmeelkorrelmorfologie met behulp van scanning elektronenmicroscopie.
Zetmeelkorrels (SG’s) vertonen verschillende morfologieën, afhankelijk van de plantensoort, vooral in het endosperm van de Poaceae-familie. Fenotypering van endosperm kan worden gebruikt om genotypen te classificeren op basis van SG-morfotype met behulp van scanning elektronenmicroscopische (SEM) analyse. SG’s kunnen worden gevisualiseerd met behulp van SEM door de kernel (pericarp, aleuronlagen en endosperm) te snijden en de organellaire inhoud bloot te leggen. De huidige methoden vereisen dat de rijstkorrel wordt ingebed in plastic hars en wordt gesneden met behulp van een microtoom of ingebed in een afgeknotte pipetpunt en met de hand wordt gesneden met behulp van een scheermesje. De eerste methode vereist gespecialiseerde apparatuur en is tijdrovend, terwijl de laatste een nieuwe reeks problemen introduceert, afhankelijk van het genotype van rijst. Vooral krijtachtige rijstvariëteiten vormen een probleem voor dit type sectie vanwege de brokkelige aard van hun endospermweefsel. Hier gepresenteerd is een techniek voor het bereiden van doorschijnende en krijtachtige rijstkorrelsecties voor microscopie, waarvoor alleen pipetpunten en een scalpelmes nodig zijn. Het bereiden van de secties binnen de grenzen van een pipetpunt voorkomt dat rijstkorrel-endosperm verbrijzelt (voor doorschijnende of ‘glasachtige’ fenotypen) en afbrokkelt (voor krijtachtige fenotypen). Met behulp van deze techniek kunnen endosperm celpatronen en de structuur van intacte SG’s worden waargenomen.
Zetmeelkorrels (SG’s) vertonen verschillende morfologieën, afhankelijk van de plantensoort, vooral in het endosperm van de Poaceae-familie 1,2. Endosperm fenotypering kan worden gebruikt om genotypen te classificeren op basis van SG-fenotype met behulp van scanning elektronenmicroscopische analyse. SG’s kunnen worden gevisualiseerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie (SEM) door de kern te snijden en de endosperm celwanden weg te wrikken2.
Het doel van deze techniek is om gemakkelijk dwarse rijstkorrelsecties te bereiden, uitsluitend voor de snelle SEM-analyse. De ontwikkeling van deze techniek werd gemotiveerd door de noodzaak van een snelle doorsnedebenadering waarbij monsters onmiddellijk voor visualisatie met minimale apparatuur worden voorbereid voor SEM-microscopie.
Deze techniek omvat het inbrengen van de gedopte rijstkorrel in de pipetpunt voor volledige immobilisatie. Dit is vooral belangrijk bij het doorsnijden van krijtachtige rijstkorrelfenotypen, die brokkelig zijn en gemakkelijk afbrokkelen onder druk3. Krijtachtigheid is een ongewenste kwaliteit in rijst omdat het het uiterlijk van de pit beïnvloedt en ervoor zorgt dat de pit gemakkelijk breekt tijdens het polijsten en malen3. Chalkiness presenteert zich als een ondoorzichtig gebied in een dwarsdoorsnede van de kern dat met het blote oog kan worden waargenomen; op microscopisch niveau wordt krijtachtigheid gekenmerkt door kleine, los verpakte zetmeelkorrels. Oorzaken van krijtachtigheid kunnen genetisch4,5 of omgeving6,7 zijn.
De doorsneden van graanzaad zijn van oudsher bereid met behulp van chemische bevestigingsmethoden en secties na monsterneming in paraffinewas of een andere vaste matrix4,8,9,10. In 2010 werd de Matsushima-methode geïntroduceerd als een manier om ingewikkelde en tijdrovende monsterbereiding van rijstkorrels te voorkomen4. Deze methode omvatte het inbrengen van de gedopte rijstkorrel in een afgeknotte pipetpunt. De punt wordt stationair gehouden door een bloktrimmer en dunne, gedeeltelijke endospermsecties worden geoogst met behulp van een handmesje. Een andere snelle techniek die in 2016 werd ontwikkeld, maakte het mogelijk om een grote verscheidenheid aan droge zaden dun te maken, waaronder kalkachtige variëteiten10. Deze methoden motiveerden de ontwikkeling van de hier gepresenteerde snelle techniek.
Deze nieuwe techniek is geschikt voor onderzoekers die intacte dwarsdoorsneden van rijstkorrels willen verkrijgen voor endospermfenotypering en zetmeelmorfologie-analyse met behulp van SEM.
Dit protocol vertegenwoordigt een aanpassing van de Matsushima afgeknotte pipetpuntmethode4, met verschillende opmerkelijke wijzigingen: (1) kernels worden op geen enkel punt van de techniek geïmpliceerd; (2) Noch een bloktrimmer, noch een ultramicrotoom zijn nodig om de secties voor te bereiden. Een wild type ‘doorschijnende’ cultivar (Oryza sativa L. ssp. japonica cv. Nipponbare) en een gemuteerde ‘krijtachtige’ lijn van Nipponbare (ssg1, ondermaats zetmeelkorrel1)4 werden in deze studie onderzocht. Deze twee cultivars werden geselecteerd voor de analyse hier om de technische en visuele verschillen in de verwerking van doorschijnende en krijtachtige rijstsecties aan te tonen.
De hier gepresenteerde techniek vertegenwoordigt een snelle, eenvoudige en scherpe benadering van het voorbereiden van dwarsdoorsneden van dwarsdoorgangen voor desktop SEM-visualisatie. Deze sectioning-techniek maakt de snelle observatie mogelijk van endospermstructuur, endosperm celvorm, grootte en patroon, samengestelde korrels en zetmeelmorfologie. Met het oog op fenotypering van endosperm en kiemplasmascreening is het van cruciaal belang om een volledige doorsnede van de rijstkorrel te verkrijgen4,23,24. Het is van het grootste belang om de pit volledig in de pipetpunt in te brengen om te voorkomen dat de druk van het scalpelmes het endosperm dwingt om af te brokkelen of te verbrijzelen. Mits de ‘telescoop’-assemblage goed is geconstrueerd, kunnen monsters binnen 15 seconden worden voorbereid voor visualisatie (tabel 2) met behulp van materialen die al in de hand zijn in een typische laboratoriumomgeving. Deze techniek is toepasbaar op de doorsnede van elk ellipsoïdaal zaad met een diameter van ongeveer vier millimeter op het breedste punt. Zaden van het modelgras Brachypodium distachyon (Figuur S2A) kunnen op dezelfde manier worden gesneden, maar blijven niet ingesloten in de annulus. Grotere zaden, zoals tarwe, breken gemakkelijk en vereisen zorg bij het sectieren(figuur S2B).
Er zijn echter verschillende beperkingen aan de hier gepresenteerde techniek. Secties verkregen met behulp van deze techniek zijn niet dun genoeg om het licht door te laten, wat het gebruik van deze techniek verbiedt voor op doorgelaten licht gebaseerde microscopische benaderingen zoals helder veld (500 μm maximale monsterdikte voor rijstkorrelsecties25)en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (500 nm maximale monsterdikte26 ). Het gebruik van een pipetpunt als de sectie ‘matrix’ beperkt ook de grootte van het zaad dat met deze techniek kan worden gesneden. Verdere probleemoplossing zou nodig zijn om deze techniek aan te passen voor soorten die sterk verschillen van rijst, en de grootte van de ‘matrix’ wordt beperkt door de grootte van de pipetpunten die beschikbaar zijn voor aankoop.
Een ander duidelijk voordeel dat deze techniek biedt, is de kwaliteit van monsters die kunnen worden geproduceerd uit krijtachtige fenotype rijstkorrels. Het is vermeldenswaard dat zelfs de Matsushima-studie toegaf dat het moeilijk was om doorsneden te verkrijgen met behulp van die specifieke methode voor krijtachtige fenotypen4, zoals gerepliceerd in deze studie met het oog op vergelijking (Figuur 1S). In hun geval werd het noodzakelijk om hun krijtachtige rijstmonsters chemisch te fixeren en ze in hars te verankeren voor secties. De nieuwe techniek, in combinatie met desktop SEM-beeldvorming, stelt de onderzoeker in staat om gemakkelijk dwarsdoorsneden van rijstkorrels voor microscopie te bereiden met meer consistentie dan zonder immobilisatieondersteuning(tabel 3).
In het nieuwe tijdperk van fenomics en metabolomics is het belangrijk om gemuteerde lijnen en transposon-tagged bibliotheken te monitoren om de functie en het belang van zetmeel in zaden beter te begrijpen. Bovendien bezit de Internationale Rijstgenbank meer dan 130 000 rijsttoetredingen27. Een snelle zaadfenotyperingstechniek zoals die hier wordt gepresenteerd, zou de classificatie en bemonstering voor voedingskwaliteit versnellen28. Ten slotte kan deze techniek nuttig zijn in het licht van de oprukkende gevolgen van klimaatverandering. Seizoensgebonden stress bij hoge temperaturen tijdens het vullen van graan was al geïdentificeerd als een belangrijke oorzaak van krijtachtigheid6, maar recente studies hebben de stijgende wereldwijde temperaturen betrokken bij het verhogen van de krijtachtigheid van rijstopbrengsten7,29. Dergelijke versnelde fenotypering van endosperm kan helpen een breed agrarisch beeld te geven van het effect van stijgende wereldwijde temperaturen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs zijn Systems for Research (SFR Corp.) dankbaar voor het gebruik van hun Phenom ProX Desktop SEM-instrument, evenals voor de technische bijstand van Maria Pilarinos (Systems for Research (SFR) Corp.) en Chloë van Oostende-Triplet (Cell Biology and Image Acquisition Core Facility, Faculty of Medicine, University of Ottawa). Financiering werd verstrekt door het Low Carbon Innovation Fund (LCIF) van het ministerie van Economische Ontwikkeling, Werkgelegenheid en Handel van de regering van Ontario en Proteins Easy Corp.
JMP 15 | SAS | N/A | N/A |
Leit Adhesive Carbon Tabs 12 mm (Pack of 100) | Agar Scientific | AGG3347N | N/A |
Phenom Pro Desktop SEM | Thermo Scientific | PHENOM-PRO | N/A |
Pipette Tips RC UNV 250 µL | Rainin | 17001116 | N/A |
SEM Pin Stub Ø12.7 Diameter Top, Standard Pin, Aluminium | Micro to Nano | 10-002012-50 | N/A |
Shandon Microdissecting Fine Tips Thumb Forceps, Fine Tips, 12.7 cm | Thermo Scientific | 3120019 | N/A |
Shandon Scalpel Blade No. 20, Sterile, 4.5 cm | Thermo Scientific | 28618256 | N/A |
Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle | Thermo Scientific | 5334 | N/A |
Zeiss V20 Discovery Stereomicroscope | Zeiss | N/A | N/A |