혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR
Summary
후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.
Abstract
후성 유전학 기반 백혈구 (WBC) 차동 수를 결정하기위한 멀티플렉스 액적 PCR (mdPCR) 워크플로우 및 상세한 프로토콜이 열가소성 탄성 동선 (TPE) 미세 유체 액적 발생 장치와 함께 설명된다. 후성 유전학 마커는 다른 질병에 있는 중요한 예후 값의 WBC 분체에 사용됩니다. 이는 게놈(CpG loci)에서 특정 CG-풍부한 영역의 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 달성된다. 본 논문에서, 말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 양성환처리된 DNA는 WBC 하위 집단과 상관관계가 있는 CpG loci에 특정한 프라이머 및 가수분해 형광 프로브를 포함하는 mdPCR 시약으로 액적물에서 캡슐화된다. 멀티플렉스 접근법은 별도의 mdPCR 반응없이 많은 CpG loci의 심문을 허용하여 메틸화 부위의 후성 유전학 분석을 사용하여 WBC 하위 집단의 보다 정확한 파라메트릭 측정을 가능하게합니다. 이 정확한 정량화는 다른 응용 프로그램으로 확장될 수 있고 임상 진단 및 후속 예후를 위한 이점을 강조합니다.
Introduction
백혈구 (WbCs) 조성물의 분석은 혈액학 진단에서 가장 자주 요청되는 실험실 테스트 중 하나입니다. 차동 백혈병 수는 감염, 염증, 빈혈 및 백혈병을 포함한 질병의 스펙트럼에 대한 지표역할을하며, 뿐만 아니라 여러 다른 조건에 대한 초기 예후 바이오 마커로 조사되고 있습니다. WBC 피타이핑의 금 본위제는 면역염색 및/또는 유동 세포측정을 수반하며, 이는 비용이 많이 드는 불안정하기 쉬운 형광 항체를 필요로 하며 종종 샘플 준비에 있어 작업자 의 숙련도에 크게 의존합니다. 더욱이, 이 방법은 선적 또는 나중에 분석을 위해 시료를 동결할 수 없도록 신선한 혈액 샘플에만 적용됩니다.
후성 유전학 마커는 최근에 현상변의 연구 를 위한 강력한 분석 공구로 나타났습니다. 그 후, 인간 백혈구 집단은 WBC 서브세트의 정확한 특성화를 허용하는 세포 계보 DNA 메틸화 패턴을 갖는 것으로 나타났다. 후성 유전학 마커에 기초한 형량은 신선한 혈액 샘플 수집 또는 고가의 항체에 의존하지 않는 유망한 대안을 제공하고 질병 발병 및 감수성1,,2,,3,,4,,5에대한 바이오마커로 악용될 수 있다.
유전체 전체 연구는 백혈구 하위 형에 있는 게놈 (CpG islands)에 있는 메틸화한 특정 CG 부유한 지구의 광대한 매핑을 위해 수행되었습니다 백혈구 하위 형에 특정한 후성 유전학 마커를 확인하기 위하여. PCR 프로토콜은 각각 CD3+ T 세포 및 CD4+ CD25+ 규제 T-셀 (T-Regs)에 대응하는 메틸화 유전자 영역(예: CD3Z 및 FOXP3)에 대한 이러한 이유로 개발되었습니다. Wiencke 등은 T 세포의 후성 유전학 적분화를 위한 듀플렉스 액적 PCR의 유용성을 입증하여 유동 활성화 세포 선별(FACS) 분석6과높은 상관관계를 갖는 결과를 산출하고 있다. 이러한 정량적 유전 분석 방법은미유체액7,,8에의해 활성화된 수유 에멀젼을 사용하여 0, 하나 이상의 표적 핵산 사본을 포함하는 수천 개의 이산, 체적 정의, 하위 나노리터 크기의 액적으로 템플릿 핵산 분자 및 PCR 시약을 분할하는 데 의존한다. PCR 증폭은 각 개별 액적 내에서 수행되며 각 액적의 끝점 형광 강도가 측정되어 샘플에 존재하는 표적의 절대적인 정량화를 허용합니다. 물방울 PCR은 표준 qPCR보다 더 정확하고 정확하며 기술적으로 더 간단하도록 설립되어 T 세포의 임상 평가를위한 DNA 메틸화 기반 방법이 더 유리하게 되었습니다. 급속히 떠오르는 하위 입력 방법론이지만, 다양한 메틸화 CpG 영역을 동시에 조사하기 위한 멀티플렉스 후성 유전학 분석이 부족합니다. 이것은 일상적인 백혈구 차동 수에 필요합니다.
본 명세서에서, 열가소성 탄성동체(TPE) 액적 미세유체 장치는 메틸화 특이적 멀티플렉스 액적 PCR(mdPCR)에 제시되고 사용된다. 이 기술은 특정 백혈구 하위 형, CD3+ T 세포 및 CD4+ CD25+ T-Regs를 묘사하는 데 사용되었으며, 셀 리니지 DNA 메틸화 패턴, 즉 CD3Z 및 FOXP3 CpG 영역의 후성 유전학 적 변이를 각각 기반으로합니다. DNA 추출, 양성환 변환 및 mdPCR에 대한 상세한 프로토콜은 TPE 액적 생성 장치에 대한 제조 방법과 함께 설명된다. 방법의 대표적인 결과는 제안된 접근법의 유용성을 강조하는 면역형광 염색의 것과 비교된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
제시된 실험 프로토콜 및 방법은 제조된 TPE 액적 발생기, 열 사이클러 및 형광 현미경을 사용하여 사내 mdPCR을 허용합니다. 소프트 TPE에서 TPE 접합에 소프트 TPE를 사용하는 제조 된 장치는 최종 장치가 물방울 발생기로 후속 사용하기 위해 표면 처리를 필요로하지 않도록 모든 채널 벽에 걸쳐 균일 한 소수성 표면 특성을 제공합니다. 이 물질은 정기적으로 높은 처리량,제조9,<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 캐나다 국립 연구위원회의 재정 지원을 인정합니다.
Materials
| Bio-Rad, Mississauga, ON | TFI0201 | PCR tube | |
| RAN Biotechnologies, Beverly, MA | 008-FluoroSurfactant | Fluoro-surfactant | |
| Silicon Quest International, Santa Clara, CA | |||
| Oxford Instruments, Abingdon, UK | EMCCD camera | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | MA5-16728 | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-8425-71 | ||
| CellProfiler | Used for fluorescence image analysis | ||
| Nikon, Japan | 10x objective | ||
| American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | PCS-800-011 | ||
| Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ) | p/n 200-U1 | ||
| Fisher, Canada | |||
| Vitrocom, NJ, USA | 5015 and 5010 | Borosilicate capilary tube | |
| (http://definetherain.org.uk/) | |||
| Hamamatsu, Japan | LC-L1V5 | DEL UV light source | |
| Dolomite | 3200063 | Disposable fluidic tubing | |
| Dolomite | 3200302 | Disposable fluidic tubing | |
| IDT, Coralville, IA | |||
| Nikon, Melville, NY | Upright light microscope | ||
| Cytec Industries, Woodland Park, NJ | |||
| EV Group, Schärding, Austria | |||
| Zymo Research, Irvine, CA | D5030 | ||
| Photron, San Diego, CA | |||
| IDT, Coralville, IA | |||
| Gersteltec, Pully, Switzerland | SU-8 photoresist | ||
| Fineline Imaging, Colorado Springs, CO | |||
| Qiagen, Hilden, Germany | 203603 | ||
| Image J | Used to assess droplet diameter | ||
| Anachemia, Montreal, QC | |||
| Excelitas, MA, USA | Broad-spectrum LED fluorescent lamp | ||
| Galenvs Sciences Inc., Montreal, QC | DE1010 | ||
| Hexpol TPE, Åmål, Sweden | Thermoplastic elastomer (TPE) | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 13-400-518 | ||
| Nikon, Japan | Used for image acquisition | ||
| 3M, St Paul, MN | Carrier Oil | ||
| Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R37605 | Blue fluorescent live cell stain (DAPI) | |
| IDEX Health & Science, Oak Harbor, WA | P-881 | PEEK fittings | |
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 806552 | ||
| Dow Corning, Midland, MI | |||
| ThinkyUSA, CA, USA | ARV 310 | ||
| Ihc world, Maryland, USA | IW-125-0 | ||
| Zinsser NA, Northridge, CA | 2607808 | ||
| Cetoni GmbH, Korbussen, Germany | |||
| Sigma-Aldrich, Oakville, ON | 484431 | ||
| Bio-Rad, Mississauga, ON | 1861096 | ||
| Hitachi High-Technologies, Mississauga, ON | |||
| Nikon, Melville, NY | Inverted microscope | ||
| Nikon, Japan | |||
| Loctite | AA 352 |
Referências
- Teitell, M., Richardson, B. DNA methylation in the immune system. Clinical Immunology. 109 (1), 2-5 (2003).
- Suarez-Alvarez, B., Rodriguez, R. M., Fraga, M. F., López-Larrea, C. DNA methylation: A promising landscape for immune system-related diseases. Trends in Genetics. 28 (10), 506-514 (2012).
- Suárez-Álvarez, B., Raneros, A. B., Ortega, F., López-Larrea, C. Epigenetic modulation of the immune function: A potential target for tolerance. Epigenetics. 8 (7), 694-702 (2013).
- Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A. Epigenetics and the adaptive immune response. Molecular Aspects of Medicine. 34 (4), 813-825 (2013).
- Zouali, M. . The Autoimmune Diseases. , (2014).
- Wiencke, J. K., et al. A comparison of DNA methylation specific droplet digital PCR (mdPCR) and real time qPCR with flow cytometry in characterizing human T cells in peripheral blood. Epigenetics. 9 (10), 1360-1365 (2014).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Analytical Chemistry. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Analytical Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Roy, E., Galas, J. C., Veres, T. Thermoplastic elastomers for microfluidics: Towards a high-throughput fabrication method of multilayered microfluidic devices. Lab on a Chip. 11 (18), 3193-3196 (2011).
- Roy, E., et al. From cellular lysis to microarray detection, an integrated thermoplastic elastomer (TPE) point of care Lab on a Disc. Lab on a Chip. 15 (2), 406-416 (2015).
- Malic, L., et al. Epigenetic subtyping of white blood cells using a thermoplastic elastomer-based microfluidic emulsification device for multiplexed, methylation-specific digital droplet PCR. Analyst. 44 (22), 6541-6553 (2019).
- Malic, L., et al. Polymer-based microfluidic chip for rapid and efficient immunomagnetic capture and release of Listeria monocytogenes. Lab Chip. 15 (20), 3994-4007 (2015).
- Malic, L., Morton, K., Clime, L., Veres, T. All-thermoplastic nanoplasmonic microfluidic device for transmission SPR biosensing. Lab Chip. 13 (5), 798-810 (2013).
