Få humanmikroglia fra voksent menneskelig hjernevev
Summary
Denne protokollen er en effektiv, kostnadseffektiv og robust metode for å isolere primærmikroglia fra levende, voksent, menneskelig hjernevev. Isolert primær human mikroglia kan tjene som et verktøy for å studere cellulære prosesser i homeostase og sykdom.
Abstract
Microglia er bosatt medfødte immunceller i sentralnervesystemet (CNS). Microglia spiller en kritisk rolle under utviklingen, i å opprettholde homeostase, og under infeksjon eller skade. Flere uavhengige forskningsgrupper har fremhevet den sentrale rollen som microglia spiller i autoimmune sykdommer, autoinflammatoriske syndromer og kreft. Aktiveringen av microglia i noen nevrologiske sykdommer kan direkte delta i patogene prosesser. Primær mikroglia er et kraftig verktøy for å forstå immunresponsene i hjernen, cellecelleinteraksjoner og dysregulerte mikrogliafenotyper i sykdom. Primær microglia etterligne in vivo mikrogliale egenskaper bedre enn udødeliggjort mikroglial cellelinjer. Human voksen microglia viser forskjellige egenskaper sammenlignet med humant foster og gnagermikroglia. Denne protokollen gir en effektiv metode for isolering av primær mikroglia fra voksen menneskelig hjerne. Å studere disse mikroglia kan gi kritisk innsikt i cellecelleinteraksjoner mellom microglia og andre fastboende cellulære populasjoner i CNS, inkludert oligodendrocytter, nevroner og astrocytter. I tillegg kan microglia fra forskjellige menneskelige hjerner dyrkes for karakterisering av unike immunresponser for personlig medisin og et mylder av terapeutiske applikasjoner.
Introduction
Sentralnervesystemet (CNS) er konstruert av et komplekst nettverk av nevroner og glialceller1. Blant glialcellene fungerer microglia som de medfødte immuncellene i CNS2,3. Microglia er ansvarlig for å opprettholde homeostase i den sunne CNS4. Microglia spiller også en viktig rolle i nevroutvikling, ved beskjæring synapser2. Microglia er sentrale i patofysiologien til flere nevrologiske sykdommer, inkludert, men ikke begrenset til; Alzheimers sykdom5, Parkinsons sykdom6, hjerneslag7, multippel sklerose8, traumatisk hjerneskade9, nevropatisk smerte10, ryggmargsskade11 og hjernesvulster som gliomer12.
Studier relatert til CNS homeostase og sykdommer benytter gnagermikroglia på grunn av en mangel på kostnadseffektive og tidseffektive menneskelige primære mikrogliaiisolasjonsprotokoller13. Rodent microglia ligner primær human mikroglia i uttrykk for gener som Iba-1, PU.1, DAP12 og M-CSF reseptor og har vært effektive i å forstå normal samt syk hjerne13. Interessant, uttrykket av flere immunrelaterte gener som TLR4, MHC II, Siglec-11 og Siglec-3 varierer mellom menneskelig og gnager microglia13. Uttrykket av flere gener varierer også i timelig uttrykk og i nevrodegenerative sykdommer i beggeartene 14,15. Disse signifikante forskjellene gjør menneskelig mikroglia til en viktig modell for å studere mikrogliafunksjon i homeostase og sykdom. Primær menneskelig microglia kan også være et effektivt verktøy for preklinisk screening av potensielle legemiddelkandidater16. De ovennevnte årsakene understreker det økende behovet for kostnadseffektive protokoller for isolering av primær menneskelig mikroglia.
Vi har utviklet en protokoll for isolering av primær menneskelig mikroglia fra voksent menneskelig hjernevev samlet som følge av kirurgisk vindu opprettet for tumorreseksjoner eller andre kirurgiske reseksjoner. Metoden her er betydelig forskjellig fra eksisterende metoder. Vi var i stand til å isolere og kultur microglia etter en transitttid på ca 75 minutter fra vevsamlingsstedet for å starte isolasjonsprotokollen i laboratoriet. Vi har brukt supernatant av L929 fibroblast celler for å fremme veksten av isolertmikroglia. Denne metoden fokuserer spesielt på kultur og utvikling av bare primære microglia. Den resulterende kulturen utarbeidet er ca 80% microglia. Mens andre protokoller gir en beriket kultur av mikroglia ved tetthet gradient sentrifugering, strømningscytometri og magnetiske perler, er protokollen en rask, enkel, robust og kostnadseffektiv måte å kultur primære menneskelige microglia17,18,19,20. Evnen til å utnytte kirurgisk fjernet levende voksen hjernevev i stedet for fast hjernevev fra beviser en ekstra fordel med denne metoden i motsetning til eksisterende prosedyrer18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia sikre homeostase i normal hjerne og spille sentrale roller i patofysiologien til ulike nevrologiske sykdommer4. Microglia er sentrale for nevroutvikling og dannelse av synapser2. Mikrogliale studier har vist seg avgjørende for å forstå utviklingen og utviklingen av ulike nevrologiske sykdommer4. Rodent microglia er den utbredte modellen for primære mikrogliale studier, selv om gnagermikroglia er forskjellig fra primær menneskelig mikro…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SJs laboratorium ble etablert med institusjonelle tilskudd fra IITJ og er finansiert av tilskudd fra Institutt for bioteknologi (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) og Ministry of Electronics and Information Technology Government of India (Nr. 4(16)/2019-ITEA). De menneskelige hjernevevsseksjonene ble hentet fra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur etter institusjonell etikkkomitéklarering. Vi takker Mayank Rathor, B.Tech Student medlem av Design and Arts Society IIT Jodhpur, for videografi støtte.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referências
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
