Получение человеческой микроглии от взрослых тканей мозга человека
Summary
Этот протокол является эффективным, экономически эффективным и надежным методом изоляции первичной микроглии от живой, взрослой, человеческой ткани мозга. Изолированная первичная микроглия человека может служить инструментом для изучения клеточных процессов при гомеостазе и болезнях.
Abstract
Микроглии являются резидентами врожденных иммунных клеток центральной нервной системы (ЦНС). Микроглии играют важную роль во время развития, в поддержании гомеостаза, а также во время инфекции или травмы. Несколько независимых исследовательских групп подчеркнули центральную роль, которую микроглии играют в аутоиммунных заболеваниях, аутовоспалительных синдромах и раковых заболеваниях. Активация микроглии при некоторых неврологических заболеваниях может непосредственно участвовать в патогенных процессах. Первичная микроглия является мощным инструментом для понимания иммунных реакций в головном мозге, клеточных клеточных взаимодействий и дисрегулируемых фенотипов микроглии при болезни. Первичная микроглия имитирует микроглиальные свойства vivo лучше, чем увековеченные линии микроглиальных клеток. Человеческая взрослая микроглия обладают различными свойствами по сравнению с человеческими микроглией плода и грызунов. Этот протокол обеспечивает эффективный метод изоляции первичной микроглии от взрослого человеческого мозга. Изучение этих микроглии может обеспечить критическое понимание клеточного взаимодействия между микроглией и другими резидентами клеток в ЦНС, включая олигодендроциты, нейроны и астроциты. Кроме того, микроглии из разных человеческих мозгов могут быть культуры для характеристики уникальных иммунных реакций для персонализированной медицины и множество терапевтических приложений.
Introduction
Центральная нервная система (ЦНС) построена из сложной сети нейронов и глиальных клеток1. Среди глиальных клеток, микроглии функции врожденных иммунных клеток ЦНС2,3. Microglia отвечают за поддержание гомеостаза в здоровом ЦНС4. Microglia также играют важную роль в нейроразвитии, путем обрезки синапсов2. Микроглии занимают центральное место в патофизиологии нескольких неврологических заболеваний, включая, но не ограничиваясь; Болезнь Альцгеймера5, болезнь Паркинсона6, инсульт7, рассеянный склероз8, черепно-мозговая травма9, невропатические боли10, повреждение спинного мозга11 и опухоли головного мозга, такие как глиомы12.
Исследования, связанные с ГОМеостазом ЦНС и заболеваний использовать грызунов микроглии из-за нехватки экономически эффективным и время эффективного человека первичной микроглии изоляции протоколов13. Грызун микроглии напоминают первичной микроглии человека в экспрессии генов, таких как Iba-1, PU.1, DAP12 и M-CSF рецепторов и были эффективными в понимании нормального, а также больной мозг13. Интересно, что экспрессия нескольких ген, связанных с иммунитетом, таких как TLR4, MHC II, Siglec-11 и Siglec-3 варьируется между человеком и грызунами микроглии13. Выражение нескольких генов также варьируется в височной экспрессии и в нейродегенеративных заболеваний у обоих видов14,15. Эти значительные различия делают микроглию человека важной моделью для изучения функции микроглии при гомеостазе и болезни. Первичная человеческая микроглия также может быть эффективным инструментом для доклинического скрининга потенциальных кандидатов наркотиков16. Вышеупомянутые причины подчеркивают растущую потребность в экономически эффективных протоколах для изоляции первичной микроглии человека.
Мы разработали протокол изоляции первичной микроглии человека от тканей мозга взрослого человека, собранного в результате хирургического окна, созданного для резекции опухоли или других хирургических резекций. Метод здесь значительно отличается от существующих методов. Мы смогли изолировать и культуры микроглии после транзита время около 75 минут от места сбора тканей, чтобы начать изоляционный протокол в лаборатории. Мы использовали супернатант клеток фибробластов L929 для содействия росту изолированной микроглии. Этот метод конкретно фокусируется на культуре и развитии только первичной микроглии. Подготовленная в результате культура составляет около 80% микроглии. В то время как другие протоколы обеспечивают обогащенную культуру микроглии по плотности градиента центрифугации, потока цитометрии и магнитных бусин, протокол является быстрым, простым, надежным и экономически эффективным способом культуры первичной человеческой микроглии17,18,19,20. Способность использовать хирургически удалены живой ткани мозга взрослого вместо фиксированных тканей мозга из трупов доказывает дополнительное преимущество этого метода в отличие от существующих процедур18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Микроглии обеспечивают гомеостаз в нормальном мозге и играют центральную роль в патофизиологии различных неврологических заболеваний4. Микроглии имеют центральное значение для нейроразвития и формирования синапсов2. Микроглиальные исследования оказались ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Лаборатория SJ была создана на институциональных грантах от IITJ и финансируется за счет грантов Департамента биотехнологии (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) и Министерства электроники и информационных технологий Правительства Индии (No 4 (16)/2019-ITEA). Участки ткани мозга человека были получены из Всеиндийского института медицинских наук (AIIMS) Jodhpur после институционального разрешения комитета по этике. Мы благодарим Майанк Ратор, B.Tech Студент член дизайна и искусства общества IIT Jodhpur, за поддержку видеосъемки.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
Referências
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
