Obtenção de Microglia Humana de Tecido Cerebral Humano Adulto

Resumo

Este protocolo é um método eficiente, econômico e robusto de isolar microglia primária de tecido cerebral vivo, adulto e humano. A microglia humana primária isolada pode servir como ferramenta para estudar processos celulares em homeostase e doenças.

Resumo

Microglia são células imunes inatas residentes do sistema nervoso central (SNC). A microglia desempenha um papel crítico durante o desenvolvimento, na manutenção da homeostase, e durante a infecção ou lesão. Vários grupos de pesquisa independentes têm destacado o papel central que a microglia desempenha em doenças autoimunes, síndromes autoinflamatórias e cânceres. A ativação da microglia em algumas doenças neurológicas pode participar diretamente de processos patogênicos. A microglia primária é uma ferramenta poderosa para entender as respostas imunes no cérebro, interações células-células e fenótipos de microglia desregulados na doença. Microglia primária imita propriedades microgliais in vivo melhor do que linhas de células microgliais imortalizadas. Microglia adulta humana apresenta propriedades distintas em comparação com microglia fetal e roedora humana. Este protocolo fornece um método eficiente para o isolamento da microglia primária do cérebro humano adulto. Estudar essas microglias pode fornecer insights críticos sobre as interações célula-células entre microglia e outras populações celulares residentes no CNS, incluindo oligodenrócitos, neurônios e astrócitos. Além disso, a microglia de diferentes cérebros humanos pode ser cultivada para caracterização de respostas imunes únicas para medicina personalizada e uma miríade de aplicações terapêuticas.

Introdução

O sistema nervoso central (SNC) é construído de uma complexa rede de neurônios e células gliais¹. Entre as células gliais, a microglia funciona como as células imunes inatas do CNS^2,3. A Microglia é responsável pela manutenção da homeostase no CNS⁴saudável . A microglia também desempenha um papel importante no neurodesenvolvimento, podando as sinapses². A microglia é central para a fisiopatologia de várias doenças neurológicas, incluindo, mas não restritas; Doença de Alzheimer⁵, Doença de Parkinson⁶, derrame⁷, esclerose múltipla^8,lesão cerebral traumática^9,dor neuropática^10,lesão medular¹¹ e tumores cerebrais como gliomas¹².

Estudos relacionados à homeostase e doenças do CNS utilizam microglia de roedores devido à escassez de protocolos de isolamento primário primário humano¹³. A microglia de roedores se assemelha à microglia humana primária na expressão de genes como Iba-1, PU.1, DAP12 e receptor M-CSF e tem sido eficaz na compreensão do cérebro normal e doente¹³. Curiosamente, a expressão de vários genes relacionados imunológicos como TLR4, MHC II, Siglec-11 e Siglec-3 varia entre microglia humana e^{roedora 13}. A expressão de vários genes também varia na expressão temporal e em doenças neurodegenerativas em ambas as espécies^14,15. Essas diferenças significativas fazem da microglia humana um modelo essencial para estudar a função da microglia na homeostase e na doença. A microglia humana primária também pode ser uma ferramenta eficaz para a triagem pré-clínica de potenciais candidatos a medicamentos¹⁶. As razões acima mencionadas sublinham a crescente necessidade de protocolos econômicos para o isolamento da microglia humana primária.

Desenvolvemos um protocolo para isolamento da microglia humana primária do tecido cerebral humano adulto coletado como resultado de uma janela cirúrgica criada para ressecções tumorais ou outras ressecções cirúrgicas. O método aqui é consideravelmente diferente dos métodos existentes. Conseguimos isolar e cultivar microglia após um tempo de trânsito de cerca de 75 minutos do local de coleta de tecidos para iniciar o protocolo de isolamento em laboratório. Usamos o supernascer de células fibroblastos L929 para promover o crescimento de microglia isolada. Este método foca especificamente na cultura e desenvolvimento apenas de microglia primária. A cultura resultante preparada é de cerca de 80% de microglia. Enquanto outros protocolos fornecem uma cultura enriquecida de microglia por centrífuga de gradiente de densidade, citometria de fluxo e contas magnéticas, o protocolo é uma maneira rápida, simples, robusta e econômica de cultivar microglia humana primária^{17,,18,,19,,20}. A capacidade de utilizar tecido cerebral adulto vivo removido cirurgicamente em vez de tecidos cerebrais fixos de cadáveres prova uma vantagem adicional deste método em contraste com os procedimentos existentes^18,,21.

Protocolo

Todos os tecidos foram adquiridos após liberação ética dos comitês de ética do Instituto Indiano de Tecnologia Jodhpur e do All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.

1.Aquisição e processamento de tecidos (Dia 0)

1. Colete o tecido em um tubo de 50 mL contendo 10 mL de líquido cerebrospinal artificial gelado (aCSF) (2 mM CaCl₂∙2H₂O, 10 mM de glicose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 202 mM de sacarose)²⁰. Certifique-se de que o tubo é mantido no gelo se o tecido precisar ser transferido para um local diferente.
   NOTA: Prepare aCSF em água destilada autoclavada. Filtre-o com filtro de seringa de 0,22 μm no capô laminar. Isso pode ser armazenado por 1 mês a 4 °C.
2. Limpe o tubo de coleta cuidadosamente com 70% de álcool e transfira para uma câmara de fluxo de ar asséptico laminar.
3. Descarte a ACSF cuidadosamente e pese tecido em uma condição asséptica. O peso tecidual é essencial para calcular o volume de trypsin-EDTA necessário para etapas subsequentes.
4. Mantenha o tecido em aCSF quente fresco a 37 °C por 5 minutos. Este passo é fundamental para evitar a morte celular.
5. Descarte aCSF e lave o tecido uma vez com 1x PBS (salina tamponada de fosfato) a 37 °C. Certifique-se de que todo o sangue seja lavado com lavagens repetidas da PBS (conforme necessário).
6. Incubar o tecido em PBS quente, a 37 °C, por 5 min.
7. Descarte a PBS cuidadosamente e transfira tecido para uma placa de Petri esterilizada. O PBS pode ser removido com uma pipeta. Isso evitará qualquer perda de tecido.
8. Pique o tecido em pedaços pequenos (pelo menos 1 mm³) usando um bisturi estéril. O tecido finamente picado fornece maior área de superfície tecidual para dissociação tecidual, garantindo maior rendimento.
9. Transfira o tecido picado para um tubo de 50 mL contendo tecido de 10 mL/g de 0,25% trypsin-EDTA e misture por pipetação através de uma pipeta sorológica de 10 mL. Adicione 2 mL de trippsina/EDTA a uma placa de Petri e lave bem a placa com a ajuda da pipeta. Adicione este trypsin de volta ao tubo falcão. Isso minimiza a perda de tecido e células durante o dicing.
10. Incubar o tubo em um agitador por 30 minutos a 37 °C a 250 rpm. Esta etapa aumenta a dissociação das células do tecido.
11. Ao final da incubação, adicione 10 mL de meio neutralizante (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS) para neutralizar a trippsina. Misture com uma pipeta sorológica de 10 mL. A quantidade de mídia neutralizante adicionada deve ser igual à quantidade de trippsina usada.
12. Centrifugar o tubo a 2.000 x g a 4 °C por 10 minutos.
13. Descarte o supernasciante e suspenda a pelota em 1 mL de cultura média (50% DMEM/50% F12 com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 20% supernanato L929, 10% FBS).
    NOTA: As células L929 são cultura no DMEM (DMEM com glutamina, 1% penicilina-estreptomicina, 10% FBS). O método de cultura recomendado pela ATCC deve ser seguido para a cultura celular. O supernascido deve ser coletado do frasco de cultura que é pelo menos 75% confluente. Pode ser coletado a granel e armazenado a -80 °C para evitar a degradação dos fatores de crescimento. Recomenda-se adicionar L929 supernacido separadamente em frascos em vez de adicionar ao meio de cultura de estoque.
14. Emplaque as células em um frasco T-25, adequado para células aderentes, e adicione 4 mL de meio de cultura adicional. Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO₂. Agite cuidadosamente o frasco para dispersar o tecido de forma homogênea. Evite trazer a mídia para o pescoço do frasco, enquanto treme, pois isso pode aumentar as chances de contaminação.

2.Cultura celular (dia 2)

1. Colete a mídia do frasco de cultura T-25 preparado no dia 0 em três tubos de centrífugas de 1,5 mL coletando o mesmo volume de mídia em cada tubo. Lave o frasco uma vez com 1 x PBS. Agite o frasco suavemente para remover quaisquer fragmentos de tecido remanescentes deixados. Evite o tremor severo do frasco, pois qualquer fragmento remanescente não afetará negativamente a cultura. Adicione 5 mL de mídia de cultura fresca ao frasco.
2. Centrifugar a mídia coletada a 1.466 x g (4000 rpm) a 4 °C por 4 minutos.
3. Descarte o supernasal de cada tubo e adicione 1 mL de meio de cultura a um dos tubos. Misture bem com a pipeta. Adicione em série a mídia mista com células a outros tubos. Misture bem com a pipeta e misture as células em um tubo.
4. Coloque as células em um frasco T-25 separado, adequado para células aderentes. Adicione 4 mL de cultura média e incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO₂.

3.Cultura celular (dia 4)

1. Descarte a mídia de ambos os frascos e adicione 5 mL frescos de mídia cultural ao frasco.
2. Incubar o frasco a 37 °C com 5% de CO₂ durante 2 dias.

4. Cultura Celular (Dia 6)

1. As células estarão prontas para mais experimentos.

Resultados

Usando o protocolo acima mencionado (Figura 1), conseguimos isolar microglia humana primária de tecidos cerebrais ressecados cirurgicamente vivos. As células cultivadas foram manchadas com Ricinus communis agglutinin-1 (RCA-1) lectina para microglia (verde) e com proteína ácida fibrilar glia (GFAP) para astrócitos (vermelho) (Figura 2) como descrito anteriormente^22,23<...

Discussão

Microglia garante homeostase no cérebro normal e desempenha papéis centrais na fisiopatologia de várias doenças neurológicas⁴. Microglia são centrais para o neurodesenvolvimento e formação de sinapses². Estudos microgliais têm se mostrado fundamentais na compreensão do desenvolvimento e progressão de diversas doenças neurológicas⁴. A microglia de roedores é o modelo predominante de escolha para estudos microgliais primários, embora, a microglia de ro...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução antibiótica-antimicótica	Himedia	A002
Cloreto de cálcio	Sigma	223506
Centrífuga (4 ° C)	Tubos	Sigma 146532
	Abdos	P10203
CO2< / sub> incubadora	New Brunswik	Galaxy 170 S
D-Glucose	Himedia	GRM077
DMEM com glutamina	Himedia	AL007S
Soro bovino fetal	Himedia	RM9955
Tubo de frasco (50 ml)	Thermo Fsiher Scientific	50CD1058
Fluoresceína Ricinus communis aglutinina-1	Vector	FL-1081
Microscópio fluorescente	Leica	DM2000LED
Fluoroshield com DAPI	Sigma	F6057
GFAP anticorpo	GA5	3670S
Incubadora	New Brunswik Scientific	Innova 42
L929 linha celular	ATCC	NCTC clone 929 [célula L, L-929, derivado da cepa L] (ATCC  CCL-1)
Fluxo de ar laminar	Thermo Fsiher Scientific	1386
Cloreto de magnésio	Himedia	MB040
Fosfato monossódico	Merck	567545
Mistura de nutrientes F-12 Presunto Médio	Himedia	Al106S
Placa de Petri	Duran Grupo	237554805
Solução salina tamponada com fosfato	Himedia	ML023
Cloreto	de potássioHimedia	MB043
Pipeta sorológica		Labware LW-SP1010
Bicarbonato de sódio	Himedia	MB045
Sacarose	Himedia	MB025
Filtro de seringa (0,2μ, 25 mm de diâmetro)	Frascos de	SFPV25R
T-25 adequados para cultura de células aderentes.	Himedia	TCG4-20X10NO
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	Rolamento 25200-056

de centrífuga cultura de tecidos Axiva