In Vivo Intracellulär inspelning av typidentifierade Rat Spinal Motoneurons Under Trans-Spinal Direct Current Stimulation
Summary
Detta protokoll beskriver in vivo intracellulära inspelningen av råtta ländryggen motoneurons med samtidig trans-spinal direkt nuvarande stimulering. Metoden gör det möjligt för oss att mäta membranegenskaper och att registrera rytmisk bränning av motoneuroner före, under och efter anodal eller katodalpolarisering av ryggmärgen.
Abstract
Intracellulära inspelning av spinal motoneurons in vivo ger en “guldmyntfot” för att bestämma cellernas elektrofysiologiska egenskaper i intakt spinal nätverket och har betydande fördelar i förhållande till klassisk in vitro eller extracellulära inspelningstekniker. En fördel med in vivo intracellulära inspelningar är att denna metod kan utföras på vuxna djur med ett fullt moget nervsystem, och därför kan många observerade fysiologiska mekanismer översättas till praktiska tillämpningar. I denna metodologiska papper beskriver vi detta förfarande i kombination med externt tillämpas konstant ström stimulering, som härmar polarisering processer som förekommer inom spinal neuronala nätverk. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) är en innovativ metod som alltmer används som en neuromodulatorisk intervention i rehabilitering efter olika neurologiska skador samt inom idrott. Påverkan av tsDCS på nervsystemet förblir dåligt förstådd och de fysiologiska mekanismerna bakom dess handlingar är till stor del okända. Tillämpningen av tsDCS samtidigt med intracellulära inspelningar gör det möjligt för oss att direkt observera förändringar av motoneuron membran egenskaper och egenskaper rytmisk bränning som svar på polariseringen av spinal neuronala nätverket, vilket är avgörande för förståelsen av tsDCS åtgärder. Dessutom, när det presenterade protokollet omfattar identifiering av motoneuron med avseende på en innervated muskel och dess funktion (flexor kontra extensor) samt den fysiologiska typen (snabb kontra långsam) det ger en möjlighet att selektivt undersöka påverkan av tsDCS på identifierade komponenter i spinal kretsar, som verkar vara annorlunda påverkas av polarisering. Det presenterade förfarandet fokuserar på kirurgiska förberedelser för intracellulära inspelningar och stimulering med tonvikt på de steg som är nödvändiga för att uppnå förberedelse stabilitet och reproducerbarhet av resultat. Detaljerna i metodiken för anodal- eller cathodal tsDCS-applikationen diskuteras samtidigt som man uppmärksammar praktiska frågor och säkerhetsfrågor.
Introduction
Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) vinner erkännande som en potent metod för att modifiera spinal krets retbarhet i hälsa och sjukdom1,2,3. I denna teknik, en konstant ström skickas mellan en aktiv elektrod som ligger ovanför utvalda spinal segment, med en referenselektrod belägen antingen ventrally eller mer rostrally4. Flera studier har redan bekräftat att tsDCS kan användas vid hantering av vissa patologiska tillstånd, såsom neuropatisksmärta 5, spasticitet6, ryggmärgsskada7 eller för att underlätta rehabilitering8. Forskare föreslår att tsDCS framkallar förändringar i jonfördelningen mellan det intracellulära och det extracellulära utrymmet över cellmembranet, och detta kan antingen underlätta eller hämma neuronal aktivitet beroende på den nuvarandeinriktningen 9,10,11. Men tills nyligen, en direkt bekräftelse av detta inflytande på motoneurons saknades.
Här beskriver vi ett utförligt protokoll för att genomföra in vivo intracellulära registrering av elektriska potentialer från ryggradens spinal motoneurons i den sövda råttan med samtidig tillämpning av tsDCS, i syfte att observera förändringar i motoneuron membran och bränning egenskaper som svar på anodal eller cathodal polarisation av spinal neuronala nätverket. Intracellulära inspelningar öppna flera områden av utredning av neuron egenskaper, otillgänglig för tidigare använt extracelluläratekniker 9,12. Till exempel är det möjligt att exakt mäta motoneuron membran spänningsrespons på direktströmsflöde som induceras av tsDCS, för att indikera spänningströskel för spike generation, eller att analysera åtgärder potentiella parametrar. Dessutom gör denna teknik oss att bestämma motoneuron passiva membran egenskaper, såsom ingångsmotstånd, och att observera förhållandet mellan intracellulär stimuleringsström och frekvens av rytmisk bränning av motoneurons. Antidromic identifiering av inspelade motoneuron, baserat på stimulering av funktionellt identifierade nerver (dvs. nerver ger efferents till flexors eller extensors) tillåter oss att dessutom identifiera typer av innervated motor enheter (snabb kontra långsam), vilket ger en möjlighet att testa om polarisering påverkar olika enskilda delar av mogna spinal neuronala systemet. På grund av omfattande kirurgi föregår inspelningen och höga krav på stabilitet och tillförlitlighet av inspelningar, är denna teknik mycket utmanande men tillåter direkt och långsiktig bedömning av elektrofysiologiska egenskaper hos en motoneuron: före, under och efter tillämpning av tsDCS, som är avgörande för att avgöra både dess akuta åtgärder och långlivade effekter13. Som en motoneuron direkt aktiverar extrafusal muskelfibrer14 och tar del i återkoppling kontroll av en muskelkontraktion och utvecklat kraft15,16 någon observerad påverkan av tsDCS på motorenheten eller muskel kontraktil egenskaper kan kopplas till modulationer av motoneuron retbarhet eller bränning egenskaper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om den utförs korrekt, bör den kirurgiska delen av det beskrivna protokollet slutföras inom cirka tre timmar. Man bör vara särskilt noga med att upprätthålla stabila fysiologiska förhållanden hos ett djur under operationen, i synnerhet kroppstemperatur och djup anestesi. Bortsett från uppenbara etiska överväganden, kan en brist på korrekt anestesi resultera i överdriven lem rörelser under nerv dissekering eller laminectomy och leda till skador på preparatet eller en för tidig experiment uppsägning. Vid …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Science Center-anslaget nr 2017/25/B/NZ7/00373. Författare skulle vilja erkänna arbete Hanna Drzymała-Celichowska och Włodzimierz Mrówczyński, som båda bidragit till datainsamling och analys av resultaten som presenteras i denna uppsats.
Materials
| Durgs and solutions | – | – | – |
| Atropinum sulfuricum | Polfa Warszawa | – | – |
| Glucose | Merck | 346351 | – |
| NaHCO3 | Merck | 106329 | – |
| Pancuronium Jelfa | PharmaSwiss/Valeant | – | Neuromuscular blocker |
| Pentobarbital sodium | Biowet Puławy Sp. z o.o | – | Main anesthetic agent |
| Pottasium citrate | Chempur | 6100-05-06 | – |
| Tetraspan | Braun | – | HES solution |
| Surgical equipment | – | – | – |
| 21 Blade | FST | 10021-00 | Scalpel blade |
| Cauterizer | FST | 18010-00 | – |
| Chest Tubes | Mila | CT1215 | – |
| Dumont #4 Forceps | FST | 11241-30 | Muscle forceps |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11254-20 | Dura forceps |
| Dumont #5F Forceps | FST | 11255-20 | Nerve forceps |
| Dumont #5SF Forceps | FST | 11252-00 | Pia forceps |
| Forceps | FST | 11008-13 | Blunt forceps |
| Forceps | FST | 11053-10 | Skin forceps |
| Hemostat | FST | 13013-14 | – |
| Rongeur | FST | 16021-14 | For laminectomy |
| Scissors | FST | 15000-08 | Vein scissors |
| Scissors | FST | 15002-08 | Dura scissors |
| Scissors | FST | 14184-09 | For trachea cut |
| Scissors | FST | 104075-11 | Muscle scissors |
| Scissors | FST | 14002-13 | Skin scissors |
| Tracheal tube | – | – | Custom made |
| Vein catheter | Vygon | 1261.201 | – |
| Vessel cannulation forceps | FST | 18403-11 | – |
| Vessel clamp | FST | 18320-11 | For vein clamping |
| Vessel Dilating Probe | FST | 10160-13 | For vein dissection |
| Sugrgical materials | – | – | – |
| Gel foam | Pfizer | GTIN 00300090315085 | Hemostatic agent |
| Silk suture 4.0 | FST | 18020-40 | – |
| Silk suture 6.0 | FST | 18020-60 | – |
| Equipment | – | – | – |
| Axoclamp 2B | Molecular devices | discontinued | Intracellular amplifier/ new model Axoclamp 900A |
| CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor | CWE | 11-10000 | Gas analyzer |
| Grass S-88 | A-M Systems | discontinued | Constant current stimulator |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus | 507222F | Heating system |
| ISO-DAM8A | WPI | 74020 | Extracellular amplifier |
| Microdrive | – | – | Custom made/replacement IVM/Scientifica |
| P-1000 Microelectrode puller | Sutter Instruments | P-1000 | Microelectrode puller |
| SAR-830/AP Small Animal Ventilator | CWE | 12-02100 | Respirator |
| Support frame | – | – | Custom made/replacement lab standard base 51601/Stoelting |
| Spinal clamps | – | – | Custom made/replacement Rat spinal adaptor 51695/Stoelting |
| TP-1 DC stimulator | WiNUE | – | tsDCS stimulator |
| Miscellaneous | – | – | – |
| 1B150-4 glass capillaries | WPI | 1B150-4 | For microelectrodes production |
| Cotton wool | – | – | – |
| flexible tubing | – | – | For respirator and CO2 analyzer connection |
| MicroFil | WPI | MF28G67-5 | For filling micropipettes |
| Silver wire | – | – | For nerve electrodes |
Referências
- Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance. Frontiers in Physiology. 8, 90 (2017).
- Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance. PloS One. 12 (4), 0173846 (2017).
- Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level. Neurociência. 393, 150-163 (2018).
- Parazzini, M., et al. Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS). Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).
- Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury. Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).
- Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects. The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).
- de Araújo, A. V. L., et al. Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis. Spinal Cord. , (2020).
- de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review. Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114 (2019).
- Ahmed, Z. Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity. Physiological Reports. 4 (3), (2016).
- Bolzoni, F., Jankowska, E. Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations. The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).
- Cogiamanian, F., et al. Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation. Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).
- Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat. The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).
- Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).
- Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior. Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).
- Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions. Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).
- Gardiner, P. F. Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius. Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).
- Ahmed, Z. Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms. Physiological Reports. 2 (9), (2014).
- Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).
- Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).
- Bączyk, M., Jankowska, E. Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers. Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats. Journal of Applied Physiology. 126 (5), 1232-1241 (2019).
- Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats. European Journal of Neuroscience. , (2019).
- Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS. Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).
- Rahman, A., et al. Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects. The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).
- Bikson, M., et al. Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro. The Journal of Physiology. 557, 175-190 (2004).
- Jankowska, E. Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials. Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).
- Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones. The Journal of Physiology. 573, 663-677 (2006).
