Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen
Summary
We beschrijven de procedure voor de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in neuronale cellen met behulp van de hanging drop-methode. Verder voeren we een uitgebreide fenotypische analyse uit via RT-qPCR, immunofluorescentie, RNA-seq en flowcytometrie.
Abstract
We beschrijven de stapsgewijze procedure voor het kweken en differentiëren van embryonale stamcellen van muizen in neuronale afstammingslijnen, gevolgd door een reeks testen om de gedifferentieerde cellen te karakteriseren. De embryonale stamcellen van de E14-muis werden gebruikt om embryoïde lichamen te vormen via de hanging drop-methode en vervolgens geïnduceerd om te differentiëren in neurale voorlopercellen door retinoïnezuur en uiteindelijk gedifferentieerd in neuronen. Kwantitatieve reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR) en immunofluorescentie-experimenten onthulden dat de neurale voorlopers en neuronen overeenkomstige markers vertonen (nestine voor neurale voorlopers en neurofilament voor neuronen) op respectievelijk dag 8 en 12 postdifferentiatie. Flowcytometrie-experimenten op een E14-lijn die een Sox1-promotorgestuurde GFP-verslaggever tot expressie bracht, toonden aan dat ongeveer 60% van de cellen op dag 8 GFP-positief is, wat wijst op de succesvolle differentiatie van neurale voorlopercellen in dit stadium. Ten slotte werd RNA-seq-analyse gebruikt om de wereldwijde transcriptomische veranderingen te profileren. Deze methoden zijn nuttig voor het analyseren van de betrokkenheid van specifieke genen en paden bij het reguleren van de celidentiteitstransitie tijdens neuronale differentiatie.
Introduction
Sinds hun eerste afleiding van de binnenste celmassa van de zich ontwikkelende muizenblastocysten1,2,zijn embryonale stamcellen van muizen (mESC) gebruikt als krachtige hulpmiddelen om zelfvernieuwing en differentiatie van stamcellen te bestuderen3. Bovendien leidt het bestuderen van mESC-differentiatie tot een enorm begrip van moleculaire mechanismen die de efficiëntie en veiligheid in op stamcellen gebaseerde therapie bij de behandeling van ziekten zoals neurodegeneratieve aandoeningen kunnen verbeteren4. In vergelijking met diermodellen biedt dit in vitro systeem veel voordelen, waaronder eenvoud in praktijk en beoordeling, lage kosten bij het onderhouden van cellijnen in tegenstelling tot dieren en relatief gemak bij genetische manipulaties. De efficiëntie en kwaliteit van gedifferentieerde celtypen worden echter vaak beïnvloed door verschillende lijnen van mESCs en de differentiatiemethoden5,6. Ook zijn de traditionele assays om de efficiëntie van differentiatie te evalueren afhankelijk van kwalitatief onderzoek van geselecteerde markergenen die geen robuustheid hebben en daarom geen wereldwijde veranderingen in genexpressie begrijpen.
Hier willen we een batterij testen gebruiken voor systematische beoordeling van de neuronale differentiatie. Met behulp van zowel traditionele in vitro analyses op geselecteerde markers als RNA-seq, zetten we een platform op voor het meten van de differentiatie-efficiëntie en de transcriptomische veranderingen tijdens dit proces. Op basis van een eerder vastgesteld protocol7genereerden we embryoïde lichamen (EB’s) via de hanging drop-techniek, gevolgd door inductie met behulp van suprafysiologische hoeveelheid retinoïnezuur (RA) om neurale voorlopercellen (NPC’s) te genereren, die vervolgens werden gedifferentieerd naar neuronen met neuraal inductiemedium. Om de efficiëntie van de differentiatie te onderzoeken, voerden we, naast traditionele RT-qPCR- en immunofluorescentie (IF) -assays, RNA-seq- en flowcytometrie uit. Deze analyses bieden uitgebreide meting van de progressie van de stadiumspecifieke differentiatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode voor neurale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen is al tientallen jaren vastgesteld en onderzoekers zijn doorgegaan met het wijzigen van de vorige protocollen of het creëren van nieuwe protocollen voor verschillende doeleinden7,10,11. We gebruikten een reeks assays om de efficiëntie en voortgang van de differentiatiestadia van mESCs naar neuronen uitgebreid te analyseren, die kunnen worden gebruikt b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de NIH (1R35GM133496-01) aan Z. Gao. We willen Dr. Ryan Hobbs bedanken voor de hulp bij het sectieren. We bedanken de kernfaciliteiten van Penn State College of Medicine, waaronder de Genome Sciences en Bioinformatics, de Advanced Light Microscopy Imaging en de Flow Cytometry. We bedanken ook Dr. Yuka Imamura voor de hulp bij RNA-seq analyse.
Materials
| 0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
| 16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
| 40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
| m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
| MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
| mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
| mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
| mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
| N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
| – Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
| – Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
| – Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| – Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
| Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
| Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
| TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
Referências
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78, 7634-7638 (1981).
- Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
- Sugaya, K., Vaidya, M. Stem Cell Therapies for Neurodegenerative Diseases. Exosomes, Stem Cells and MicroRNA: Aging, Cancer and Age Related Disorders. , 61-84 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- McKee, C., Chaudhry, G. R. Advances and challenges in stem cell culture. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 159, 62-77 (2017).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature Neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Wang, Q., et al. WDR68 is essential for the transcriptional activation of the PRC1-AUTS2 complex and neuronal differentiation of mouse embryonic stem cells. Stem Cell Research. 33, 206-214 (2018).
- Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nature Biotechnology. 21 (2), 183-186 (2003).
- Visan, A., et al. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells as a tool to assess developmental neurotoxicity in vitro. NeuroToxicology. 33 (5), 1135-1146 (2012).
- Fraichard, A., et al. In vitro differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. Journal of Cell Science. 108 (10), 3181-3188 (1995).
- Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochemical So. 31, 45-49 (2003).
- Park, Y. -. G., et al. Effects of Feeder Cell Types on Culture of Mouse Embryonic Stem Cell In vitro. Development & Reproduction. 19 (3), 119-126 (2015).
- Lee, J. H., Lee, E. J., Lee, C. H., Park, J. H., Han, J. Y., Lim, J. M. Requirement of leukemia inhibitory factor for establishing and maintaining embryonic stem cells in mice. Fertility and Sterility. 92 (3), 1133-1140 (2009).
- Onishi, K., Zandstra, P. W. LIF signaling in stem cells and development. Development (Cambridge). 142 (13), 2230-2236 (2015).
- Smith, A. G., et al. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides. Nature. 336, 688-690 (1988).
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Ghimire, S., et al. Comparative analysis of naive, primed and ground state pluripotency in mouse embryonic stem cells originating from the same genetic background. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Kurosawa, H., Imamura, T., Koike, M., Sasaki, K., Amano, Y. A Simple Method for Forming Embryoid Body from Mouse Embryonic Stem Cells. Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 409-411 (2003).
- Wang, X., Yang, P. In vitro differentiation of mouse embryonic stem (mES) cells using the hanging drop method. Journal of Visualized Experiments. (17), 2-3 (2008).
- Soprano, D. R., Teets, B. W., Soprano, K. J. Role of Retinoic Acid in the Differentiation of Embryonal Carcinoma and Embryonic Stem Cells. Vitamins and Hormones. 75 (06), 69-95 (2007).
- Venere, M., Han, Y. G., Bell, R., Song, J. S., Alvarez-Buylla, A., Blelloch, R. Sox1 marks an activated neural stem/progenitor cell in the hippocampus. Development (Cambridge). 139 (21), 3938-3949 (2012).
- Chen, Y., et al. NS21: Re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 239-247 (2008).
- Bahmad, H. F., et al. The Akt/mTOR pathway in cancer stem/progenitor cells is a potential therapeutic target for glioblastoma and neuroblastoma. Oncotarget. 9 (71), 33549-33561 (2018).
- Bastiaens, A. J., et al. Advancing a MEMS-Based 3D Cell Culture System for in vitro Neuro-Electrophysiological Recordings. Frontiers in Mechanical Engineering. 4, 1-10 (2018).
- Antill-O’Brien, N., Bourke, J., O’Connell, C. D. Layer-by-layer: The case for 3D bioprinting neurons to create patient-specific epilepsy models. Materials. 12 (19), (2019).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Joshi, P., Lee, M. Y. High content imaging (HCI) on miniaturized three-dimensional (3D) cell cultures. Biosensors. 5 (4), 768-790 (2015).
