Descrevemos o procedimento para a diferenciação in vitro de células-tronco embrionárias do rato em células neuronais usando o método de queda de suspensão. Além disso, realizamos uma análise fenotípica abrangente através do RT-qPCR, imunofluorescência, RNA-seq e citometria de fluxo.
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Artigo de método
Diferenciação e caracterização de progenitores neurais e neurônios de células-tronco embrionárias do rato
Neste artigo
Resumo
Resumo
Descrevemos o procedimento passo-a-passo para cultivar e diferenciar células-tronco embrionárias do camundongo em linhagens neuronais, seguido por uma série de ensaios para caracterizar as células diferenciadas. As células-tronco embrionárias do rato E14 foram usadas para formar corpos embrionários através do método de queda suspensa, e então induzidas a se diferenciar em células progenitoras neurais por ácido retinóico, e finalmente diferenciadas em neurônios. A reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR) e os experimentos de imunofluorescência revelaram que os progenitores e neurônios neurais exibem marcadores correspondentes (nestin para progenitores neurais e neurofilamento para neurônios) nos dias 8 e 12 pós-diferenciação, respectivamente. Experimentos de citometria de fluxo em uma linha E14 expressando um repórter gfp orientado pelo promotor Sox1 mostraram que cerca de 60% das células no dia 8 são GFP positivas, indicando a diferenciação bem sucedida das células progenitoras neurais nesta fase. Finalmente, a análise do RNA-seq foi utilizada para traçar o perfil das alterações transcriômicas globais. Esses métodos são úteis para analisar o envolvimento de genes e caminhos específicos na regulação da transição da identidade celular durante a diferenciação neuronal.
Introdução
Desde sua primeira derivação da massa celular interna dos blastocistos do camundongo em desenvolvimento1,2, as células-tronco embrionárias do rato (mESC) têm sido usadas como ferramentas poderosas para estudar a autoconexão e diferenciação das células-tronco3. Além disso, estudar a diferenciação do MEESC leva a uma tremenda compreensão dos mecanismos moleculares que podem melhorar a eficiência e a segurança na terapia baseada em células-tronco no tratamento de doenças como distúrbios neurodegenerativos4. Em comparação com os modelos animais, este sistema in vitro....
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Protocolo
1. cultura mESC
- Cubra uma placa tratada com 10 cm de tecido com gelatina de 0,1% e deixe que a gelatina se estafina por pelo menos 15-30 minutos antes de aspirar.
- Sementes γ camundongos embrionários (MEFs) um dia antes de cultivar os mESCs no meio mESC pré-aquecido (médio águia modificado de Dulbecco (DMEM) com 15% de soro bovino fetal (FBS), aminoácidos não essenciais, β-mercaptoetanol, L-glutamina, penicilina/estreptomicina, piruvato de sódio, LIF, PD0325901 (PD) e Chir99021 (CH)).
- Permita que os MEFs irradiados de γ se acomodem e se anexem à superfície da placa antes de estancar as células E14.
- Descongele E14 ESCs em banho-ma....
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Resultados
Como representação do nosso método, realizamos um experimento de EB, NPC e diferenciação de neurônios em células E14. As células E14 foram cultivadas em MEFs irradiados γ(Figura 1A)até que a população de MEF irradiada γ diluída. Confirmamos a pluripotência das células E14 realizando coloração de Fosfattase Alcalina (AP)(Figura 1B)e posteriormente RT-qPCR (veja abaixo) para marcadores Nanog e Oct4. As células E14 sem MEF γ foram então induzidas .......
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Discussão
O método de diferenciação neural de células-tronco embrionárias do camundongo foi estabelecido há décadas e os pesquisadores continuaram a modificar os protocolos anteriores ou criar novos para vários propósitos7,10,11. Utilizamos uma série de ensaios para analisar de forma abrangente a eficiência e o progresso das etapas de diferenciação dos mESCs aos neurônios, que podem ser utilizados na análise de outras diferenciações de li.......
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Divulgações
Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do NIH (1R35GM133496-01) para Z. Gao. Gostaríamos de agradecer ao Dr. Ryan Hobbs pela ajuda na secção. Agradecemos as instalações principais da Penn State College of Medicine, incluindo as Ciências do Genoma e Bioinformática, a Imagem Avançada de Microscopia de Luz e a Citometria de Fluxo. Agradecemos também ao Dr. Yuka Imamura pela assistência na análise do RNA-seq.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,05% Tripsina + 0,53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
| 0,1% Gelatina | Sigma | G1890-100G | Preparado em água desionizada |
| 16% Paraformaldeído | Thermo Scientific | 28908 | Diluído em 1X PBS |
| 40-μ filtro de células m | Falcon | 352340 | |
| Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
| AlexaFluor 488 cabra anti-camundongo IgG (H + L) | Invitrogen | A11001 | O anticorpo foi diluído a 1: 500 para IF |
| Kit de coloração de fosfatase alcalina II | Stemgent | 00-0055 | |
| AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
| Suplemento B27 | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSCanto | BD | 657338 | |
| bFGF | Sigma | 11123149001 | |
| BioAnalyzer Kit de DNA de alta sensibilidade | Agilent | 5067-4626 | |
| Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
| Clorofórmio | C298-500 | Fisher Químico | |
| DAPI | Invitrogen | R37606 | |
| DMEM | Corning | 10-017-CM | |
| DMEM/F12 médio | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| EB buffer | Qiagen | 19086 | |
| Etanol | 111000200 | Pharmco | Diluído em água desionizada |
| Soro bovino fetal | Atlanta Lâminas de microscópio Biologicals | S10250 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | |
| Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analítico | Diluído em água desionizada |
| L-glutamina | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| LIF | N/A | N/A | Coletado de primers m18srRNA sobrenadante |
| MEF IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3'MEM | |
| Aminoácidos não essenciais | Corning | 25-025-Cl | |
| mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
| mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3'mNeuroD1 |
| primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3'mOct4 |
| primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'- CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3'mPax6 |
| primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3'N2 |
| suplemento | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin anticorpo primário | Millipore | MAB5326 | O anticorpo foi diluído a 1:200 para IF |
| Neural basal | Thermo Fisher Scientific | ||
| Anticorpo primário de neurofilamento | DSHB | 2H3 | |
| NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
| PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
| Penicilina / estreptomicina | Corning | 30-002-Cl | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | N / A | N / A | Preparado em água desionizada |
| - Cloreto de potássio | P217-500G | VWR | |
| - Fosfato de potássio monobásico anidro | 0781-500G | VWR | |
| - Cloreto de sódio | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
| - Fosfato de sódio, dibásico, heptahidratado | SX0715-1 | Milipore | |
| Primer hexâmero aleatório | Thermo Scientific | SO142 | |
| Ácido retinóico | Sigma | R2625 | Preparado em DMSO |
| Piruvato de sódio | Corning | 25-000-Cl | |
| Sacarose | Sigma | 84097 | Diluído em 1X PBS |
| SuperScript III Transcriptase reversa | Invitrogen | 18064022 | |
| Tissue-Tek O.C.T. composto | Sakura | 4583 | |
| Reagente de isolamento | TriPure Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
| TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
| β-mercaptoetanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |
Referências
- Kaufman, M. H., Evans, M. J. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Martin, G. R. Isolation of a pluripotent....
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Reimpressões e permissões
