Vi beskriver förfarandet för in vitro differentiering av mus embryonala stamceller i neuronala celler med hjälp av hängande dropp metod. Dessutom utför vi en omfattande fenotypisk analys genom RT-qPCR, immunofluorescens, RNA-seq och flöde cytometri.
Vi beskriver steg-för-steg förfarandet för odling och differentiering mus embryonala stamceller i neuronal härstamningar, följt av en serie analyser för att karakterisera de differentierade cellerna. E14 mus embryonala stamceller användes för att bilda embryoid kroppar genom hängande dropp metod, och sedan induceras att differentiera i neurala stamceller genom retinsyra, och slutligen differentieras i nervceller. Kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR) och immunofluorescens experiment visade att neurala stamceller och nervceller uppvisar motsvarande markörer (nestin för neurala stamceller och neurofilament för nervceller) dag 8 och 12 post-differentiering, respektive. Flöde cytometri experiment på en E14 linje uttrycker en Sox1 promotor-driven GFP reporter visade att cirka 60% av cellerna på dag 8 är GFP positiva, vilket indikerar den framgångsrika differentiering av neurala stamceller i detta skede. Slutligen användes RNA-seq-analys för att profilera de globala transkriptomiska förändringarna. Dessa metoder är användbara för att analysera inblandning av specifika gener och vägar i regleringen av cellidentitetsövergången under neuronal differentiering.
Sedan deras första härledning från den inre cellmassan hos de framväxande mus blastocysts1,2, mus embryonala stamceller (mESC) har använts som kraftfulla verktyg för att studera stamceller självförnyelse och differentiering3. Att studera mESC-differentiering leder dessutom till en enorm förståelse för molekylära mekanismer som kan förbättra effektiviteten och säkerheten vid stamcellsbaserad terapi vid behandling av sjukdomar som neurodegenerativa sjukdomar4. Jämfört med djurmodeller ger detta in vitro-system många fördelar, inklusive enkelhet i praktiken och bedömning, låg kostnad för att upprätthålla cellinjer i motsats till djur och relativ lätthet i genetiska manipuleringar. Effektiviteten och kvaliteten hos differentierade celltyper påverkas dock ofta av olika linjer av mESC samt differentieringsmetoderna5,6. De traditionella analyserna för att utvärdera differentieringseffektiviteten bygger också på kvalitativ undersökning av utvalda markörgener som saknar robusthet och de därför inte förstår globala förändringar i genuttryck.
Här strävar vi efter att använda ett batteri av analyser för systematisk bedömning av neuronal differentiering. Med hjälp av både traditionella in vitro-analyser på utvalda markörer och RNA-seq etablerar vi en plattform för mätning av differentieringseffektiviteten samt transkriptomiska förändringar under denna process. Baserat på ett tidigare etablerat protokoll7genererade vi embryoidkroppar (EBs) genom hängande droppteknik, följt av induktion med suprafysiologic mängd retinsyra (RA) för att generera neurala stamceller (NPCs), som därefter differentierades till nervceller med neuralt induktionsmedium. För att undersöka effektiviteten i differentieringen, förutom traditionella RT-qPCR och immunofluorescens (IF) analyser, utförde vi RNA-seq och flöde cytometri. Dessa analyser ger omfattande mätning av utvecklingen av den stegspecifika differentieringen.
Metoden för neural differentiering av mus embryonala stamceller har fastställts i årtionden och forskare har fortsatt att modifiera de tidigare protokollen eller skapa nya för olika ändamål7,10,11. Vi använde en serie analyser för att omfattande analysera effektiviteten och framstegen av differentiering stadier av mESCs till nervceller, som kan användas i analys av andra härstamning differentiering av mus eller mänskl…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från NIH (1R35GM133496-01) till Z. Gao. Vi vill tacka dr Ryan Hobbs för hjälpen med sektionsavsnittet. Vi tackar Penn State College of Medicine kärnanläggningar, inklusive genomvetenskap och bioinformatik, Advanced Light Microscopy Imaging och Flow Cytometry. Vi tackar också Dr. Yuka Imamura för hjälpen i RNA-seq-analysen.
0.05% Trypsin + 0.53mM EDTA 1X | Corning | 25-052-CV | |
0.1% Gelatin | Sigma | G1890-100G | Prepared in de-ionized water |
16% Paraformaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Diluted in 1X PBS |
40-μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
Albumax | Thermo Fisher Scientific | 11020021 | |
AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A11001 | Antibody was diluted at 1:500 for IF |
Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
AzuraQuant Green Fast qPCR Mix LoRox | Azura Genomics | AZ-2105 | |
B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BD FACSCanto | BD | 657338 | |
bFGF | Sigma | 11123149001 | |
BioAnalyzer High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | |
Chir99021 | Cayman Chemicals | 13122 | |
Chloroform | C298-500 | Fisher Chemical | |
DAPI | Invitrogen | R37606 | |
DMEM | Corning | 10-017-CM | |
DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
EB buffer | Qiagen | 19086 | |
Ethanol | 111000200 | Pharmco | Diluted in de-ionized water |
Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S10250 | |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HiSeq 2500 Sequencing System | Illumina | SY-401-2501 | |
Isopropanol | BDH1133-4LG | BDH VWR Analytical | Diluted in de-ionized water |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
LIF | N/A | N/A | Collected from MEF supernatant |
m18srRNA primers | IDTDNA | N/A | 5'-GCAATTATTCCCCATGAACG-3' 5'-GGCCTCACTAAACCATCCAA-3' |
MEM Non-essential amino acids | Corning | 25-025-Cl | |
mNanog primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGGCTTTGGAGACAGTGAGGTG-3' 5'-TGGGTAAGGGTGTTCAAGCACT-3' |
mNes primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGTGCCCAGTTCTAGTGGTGTCC-3' 5'-CCTCTAAAATAGAGTGGTGAGGGTTG-3' |
mNeuroD1 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CGAGTCATGAGTGCCCAGCTTA-3' 5'-CCGGGAATAGTGAAACTGACGTG-3' |
mOct4 primers | IDTDNA | N/A | 5'-AGATCACTCACATCGCCAATCA-3' 5'-CGCCGGTTACAGAACCATACTC-3' |
mPax6 primers | IDTDNA | N/A | 5'-CTTGGGAAATCCGAGACAGA-3' 5'-CTAGCCAGGTTGCGAAGAAC-3' |
N2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
Nestin primary antibody | Millipore | MAB5326 | Antibody was diluted at 1:200 for IF |
Neural basal | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
Neurofilament primary antibody | DSHB | 2H3 | |
NEXTflex Illumina Rapid Directional RNA-Seq Library Prep Kit | BioO Scientific | NOVA-5138-07 | |
PD0325901 | Cayman Chemicals | 13034 | |
Penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | N/A | N/A | Prepared in de-ionized water |
– Potassium chloride | P217-500G | VWR | |
– Potassium phosphate monobasic anhydrous | 0781-500G | VWR | |
– Sodium chloride | BP358-10 | Fisher Bioreagents | |
– Sodium phosphate, dibasic, heptahydrate | SX0715-1 | Milipore | |
Random hexamer primer | Thermo Scientific | SO142 | |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Prepared in DMSO |
Sodium pyruvate | Corning | 25-000-Cl | |
Sucrose | Sigma | 84097 | Diluted in 1X PBS |
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18064022 | |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | |
TriPure Isolation Reagent | Sigma-Aldrich | 11667165001 | |
TruSeq Rapid | Illumina | 20020616 | |
β-mercaptoethanol | Fisher BioReagents | BP176-100 |