免疫荧光DNA修复蛋白相互作用的可视化

Summary

在DNA损伤之后，人类细胞激活必要的修复途径，以恢复其基因组的完整性。在这里，我们描述了间接免疫荧光的方法，作为检测DNA修复蛋白，分析其空间和时间招募，并帮助查询DNA损伤点蛋白质-蛋白质相互作用的方法。

Abstract

哺乳动物细胞经常暴露在化学物质、辐射和自然产生的代谢产物中，这些产物会造成特定类型的DNA侮辱。基因毒性剂可以破坏DNA骨干，破坏它，或修改单个碱基的化学性质。在DNA侮辱之后，DNA损伤反应（DDR）途径被激活，参与修复的蛋白质被招募。在感知损坏类型和激活适当的维修响应时，涉及大量因素。未能正确激活和招募 DDR 因子可能导致基因组不稳定，这是包括癌症在内的许多人类疾病的基础。DDR蛋白的研究可以提供对基因毒性药物反应和细胞耐药性机制的见解。

体内蛋白质可视化有两 种主要方法：直接观察，通过用荧光蛋白标记感兴趣的蛋白质，然后通过活体成像或固定样品上的间接免疫荧光跟踪。虽然荧光标记蛋白质的可视化允许随着时间的推移进行精确监测，但 N-或 C-术语中的直接标记可能会干扰蛋白质的定位或功能。观察蛋白质的未修改，内源版本是首选。当DNA修复蛋白被招募到DNA侮辱中时，它们的浓度会局部增加，它们形成组，或”foci”，这些组可以通过使用特异性抗体的间接免疫荧光来可视化。

虽然蛋白质叶酸的检测不能提供直接相互作用的明确证据，但细胞中蛋白质的共同定位表明它们重新组合到损伤发生地，并可以告知复杂形成所需的事件序列。仔细分析表达野生类型或蛋白质突变版本的细胞的 foci 空间重叠，可以为对 DNA 修复功能重要的功能域提供宝贵的线索。最后，蛋白质的共同定位表明可能的直接相互作用，可以通过细胞中的共免疫沉淀或使用纯化蛋白质直接下拉来验证。

Introduction

人类细胞不断暴露在各种来源的DNA破坏剂中。外源主要包括接触辐射、化学品（包括化疗剂和某些抗生素）和病毒，而主要的内源包括DNA复制和氧化应激方面的错误。基因毒性暴露的直接影响范围从改良的碱基到潜在的致命DNA双链断裂（DSB），这取决于压力和暴露剂量。最终，未修复或修复不当的DNA损伤可导致突变的积累、基因组重组、基因组不稳定，并最终导致致癌^1。哺乳动物细胞已经进化出复杂的途径来识别特定类型的DNA损伤^2,2，3，并及时修复它们，与细胞周期进展同步。

电离辐射（IR）损害DNA双螺旋，并造成双链断裂（DSB），这是最有害的DNA损伤形式之一。MRN （MRE11， RAD50， NBS1） 复合功能作为 DNA 末端的传感器，并激活蛋白激酶 ataxia telangiectasia 突变 （ATM）^4，5。在DNA端对ATM的初始激活后，ATM在断点触发一系列DDR事件，启动一个关键事件，即组蛋白变种H2AX^{6的磷酸化}。在残留物S139上的H2AX磷酸化激活它到+H2AX，跨越区域，高达围绕DNA病变^{6，7，8，97,8的巨型碱。6}这一事件增加了DNA的可访问性，导致其他DNA修复蛋白的招募和^积累7。由于 +H2AX 是丰富和具体诱导周围的 DSB，它可以很容易地可视化使用特定的抗体，并通常用作 DSB 在 DNA 修复领域的代理标记。一旦中断被发出信号，细胞激活其DNA修复途径并处理DNA损伤。蛋白质MDC1（DNA损伤检查点蛋白1的中介）直接结合+H2AX^10，与^{ATM11和NBS1 12，13,相互作用}。它有助于提高 MRN 复合物在 DSB 的浓度，并启动正 ATM 反馈回路。•一旦修复断裂，快速清除H2AX，从而允许监控DSB间隙。其次是显微镜，随着时间的推移，μH2AX 的减少提供了残余断裂和 DNA 修复效率的间接测量。

真核细胞可以通过多种途径修复DSB，两个主要途径是非同源端连接（NHEJ）和同源重组（HR）（图1）。NHEJ基本上连接DNA双链结束不使用扩展同源和在整个细胞周期^{14，15运行}。^14,HR在S和G2阶段成为占主导地位，否则被压抑，因为它需要一个姐妹色度作为一个同源模板修复^{14，16。14,}NHEJ和HR之间的路径选择不仅取决于姐妹色度的物理接近性，还取决于DNA端切除¹⁷的延伸，它抑制了NHEJ。

同源性依赖的DSB修复启动核解降解的5’链从断裂端产生3’单链DNA（ssDNA）尾部，这个过程被称为5′-3’切除。MRN复合物启动DNA端切除术，并结合BLM/EXO1（布洛姆综合征蛋白/外核酶1）或BLM/DNA2（DNA复制ATP依赖性直升机酸酶^,/核酸酶^{）18、19、20、21、22,19,20}进行进一^,步切除。²¹CtIP（CtBP相互作用蛋白）通过与 MRN 复合物²³的直接相互作用和 BRCA1（乳腺癌 1 型易感性蛋白）^{24，25的招募来}增强 DNA 末切。复制蛋白A（RPA）迅速结合到暴露的ssDNA，然后被重组酶蛋白RAD51取代，形成核蛋白丝，催化同源搜索和链入侵26，27，28。^26,27,28

切除的启动是修复路径选择的关键步骤。一旦切除开始，DNA末端成为由Ku70/Ku80异质剂（NHEJ通路的组成部分）结合的不良基质，细胞被承诺到HR 17，29，30。^17,29,30Ku70/Ku80异质剂结合到DSB末端，招募DNA-PKcs和p53结合蛋白^,1（53BP1）29，²⁹³⁰。53BP1在G1中起到切除屏障的作用，从而在推广NHEJ^31、32,32的同时阻断HR，但在S相中以BRCA1依赖的方式去除，从而允许^{切除发生33，34,34}。因此，53BP1 和 BRCA1 在 DSB 维修中扮演相反的角色，53BP1 是 NHEJ 促进者，而 BRCA1 则通过 HR 进行中断修复。

在实验室中，DSB形成可由电离辐射（IR）引起。虽然本示例利用高剂量的 4 Gy、1 Gy 和 2 Gy 也创建大量的 DSB，适合通过丰富的蛋白质分析叶层形成。需要注意的是，使用的辐射类型和剂量可导致DNA和细胞中不同的病变：虽然IR诱导DSB，它也可能导致单股断裂或碱基修饰（^{见35，36，,36}关于辐照线性能量转移（LET）和DNA损伤类型的参考）。为了确定电离辐射诱导的源（IRIF）形成的动力学及其间隙，表明修复激活的DDR^{8、9、37、38,9,37,的}损伤和反转，在电离辐射后的不同时间点可以监测源层。所有主要DNA损伤蛋白的激活和清除时间已知^为39种，许多被调查为关键事件的代理标记。例如，对 ssDNA 具有高亲和力的 pRPA 用作断分切除的代理，MRN 蛋白（MRE11、RAD50、NBS1）和外核酶也可用于评估切除效率。虽然RAD51、BRCA1、BRCA2（乳腺癌2型易感性蛋白）和PALB2（BRCA2的合作伙伴和本地化者）可以监测，以评估人力资源效率，而Ku蛋白或53BP1的存在则用作NHEJ的标记（图1）。

当DNA修复机械的蛋白质相互招募到超级复合物中分离和组装时，DNA蛋白和蛋白质-蛋白质的相互作用可以通过跟踪它们各自的定位并分析蛋白质的共同定位来推断，如^{细胞40、41、42,41,42}中的重叠信号。在细胞系中，通过基因组编辑或对质粒突变体过度表达，在特定DNA修复基因中引入点突变或删除，允许调查特定残留物及其在识别DNA损伤（例如，与+H2AX）或复杂组装（与其他蛋白质或几种蛋白质共同定位）中可能发挥的作用，以及它们对DNA修复的影响。在这里，我们使用间接免疫荧光作为一种均值，通过跟踪 +2AX foci 来研究 DSB 的形成和分辨率。我们还提出了一个示例，由 DSB 修复的主要参与者进行 foci 形成和共同定位分析：p53 结合蛋白 1 （53BP1）³²。如前所述，53BP1 被认为是 DNA 修复路径选择的核心。在 53BP1 积累及其与 +2AX 的共定位后，提供了有关细胞周期相、DNA损伤积累和用于修复 DSB 的路径的宝贵信息。间接免疫定位的目的是评估细胞系DNA损伤修复的效率，如本研究中的IR之后，或在接触细胞中的各种应力后，从DNA交联到复制分叉的阻塞（表1提供了DNA损伤剂列表）。

图1：DNA双链断裂（DSB）修复途径。
DSB 修复涉及两个主要途径：同源重组（HR、左）和非同源端连接（NHEJ，右）。断裂后，蛋白质被激活以标记断裂（+2AX），参与最终切除（MRN），涂上被切除的ssDNA（pRPA），促进重组（BRCA1，PALB2，BRCA2，RAD51）或限制切除，促进NHEJ（53BP1）。其他蛋白质参与损伤修复，但列出的蛋白质通常遵循间接免疫荧光。 请单击此处查看此图的较大版本。

DNA损伤剂	行动机制	推荐剂量
• 射线/X 射线	辐射 形成双链断裂与一些不受控制的细胞效应	1-4 Gy
36Ar 离子	辐射 双链断裂的形成	270千瓦/μm
• 粒子	辐射 双链断裂的形成	116 keV/μm
博莱 霉 素	DNA合成的抑制剂	0.4-2 μg/mL
喜 树 碱	托托莫默酶 I 的抑制剂	10-200 nM
顺 铂	阿尔基拉特剂 （诱导海峡内部交联）	0.25-2 μM
阿 霉 素	中间代理 托托莫默酶II.的抑制剂	10-200 nM
埃托波赛德	托托莫默酶II.的抑制剂	10 μM
羟基尤雷亚	DNA合成的抑制剂 （由核糖核酸还原酶）	10-200 μM
甲基甲烷硫化甲酸酯	阿尔基拉特剂	0.25-2 mM
米托米霉素 C	阿尔基拉特剂	0.25-2 μM
紫外线（UV）光	甲状腺素二丁的形成 （产生DNA链失真）	50-100 mJ/厘米2

表1：基因毒性剂.DNA损伤剂的例子，其作用机制和根据建议的工作浓度引起的损伤。

Protocol

1. 希拉细胞培养 在 50°C 下预处理带 1 M HCl 的圆形玻璃盖玻片，使用 16-18 小时。用 ddH2O 冲洗，并储存在 100% Etoh 中。 准备细胞培养基：向DMEM培养基添加10%（v/v）FBS。 在无菌 12 井板中生长 4.0 x10 4 细胞/井，在加湿培养箱中用 18 mm 圆形玻璃盖玻片和 5%CO2。 将细胞生长到80%的汇合（约24小时）。 2. 放射治疗的细胞治疗 ?…

Representative Results

第2天，或24小时后种子细胞在盖玻片上，细胞经历了一个分裂，是80%的汇合。DNA修复蛋白中特定的击倒或突变可以增加加倍的时间，或使细胞对基因毒性治疗敏感，种子密度以及治疗剂量应相应调整。为了确定最佳工作条件，随着时间的推移，西方的αH2AX的印迹可以确定DNA损伤反应的时间，并且可以通过菌落形成测定来确定对辐照的敏感性。 未经过辐照处理的细胞（如果有?…

Discussion

通过显微镜分析DNA损伤修复的时机和效率，已证明对了解DNA修复机械在正常细胞和人类疾病（如癌症）中如何工作至关重要。

特异性抗体的培养，允许检测活性蛋白在其磷酸化版本（如+H2AX，pRPA，pRAD50和其他^{10，23，39，43）,39,43}在更好地了解DNA修复时间的事件及其与细胞周期的同步。¹⁰<su…

Materials

16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips)	Neuvitro	NC0308920	Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate]	Gibco	11965118	Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Research Products International	E57060	Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	104370028	The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2)	Research Products International	M24000	Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Research Products International	P40150	Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl)	Research Products International	S23020	Nuclear extraction buffer.
Sucrose	Research Products International	S24060	Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells	Costar	3513	Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red	Gibco	12604021	Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red	Gibco	15400054	TrypLE can be used instead.