Visualisering af DNA Reparation Proteiner Interaktion ved Immunofluorescence

Summary

Efter DNA-skader aktiverer humane celler vigtige reparationsveje for at genoprette integriteten af deres genom. Her beskriver vi metoden til indirekte immunfluorescens som et middel til at detektere DNA-reparationsproteiner, analysere deres rumlige og tidsmæssige rekruttering og hjælpe med at afhøre proteinproteininteraktion på steder med DNA-skader.

Abstract

Pattedyrceller er konstant udsat for kemikalier, stråling, og naturligt forekommende metaboliske biprodukter, som skaber specifikke typer af DNA-fornærmelser. Genotoksiske midler kan beskadige DNA-rygraden, bryde den eller ændre den kemiske karakter af individuelle baser. Efter DNA-fornærmelse aktiveres DNA-skadesresponsveje (DDR), og proteiner, der er involveret i reparationen, rekrutteres. En overflod af faktorer er involveret i sensing typen af skader og aktivere passende reparation svar. Undladelse af korrekt aktivere og rekruttere DDR faktorer kan føre til genomisk ustabilitet, som ligger til grund for mange menneskelige patologier, herunder kræft. Undersøgelser af DDR-proteiner kan give indsigt i genotoksisk lægemiddelrespons og cellulære mekanismer for lægemiddelresistens.

Der er to vigtige måder at visualisere proteiner in vivo:direkte observation, ved at mærke protein af interesse med et fluorescerende protein og efter det ved levende billeddannelse, eller indirekte immunfluorescens på faste prøver. Mens visualisering af fluorescerende mærkede proteiner giver mulighed for præcis overvågning over tid, direkte mærkning i N- eller C-endestation kan forstyrre protein lokalisering eller funktion. Observation af proteiner i deres uændrede, endogene version foretrækkes. Når DNA reparation proteiner rekrutteres til DNA-fornærmelse, deres koncentration stiger lokalt, og de danner grupper, eller “foci”, der kan visualiseres ved indirekte immunfluorescens ved hjælp af specifikke antistoffer.

Selv om påvisning af protein foci ikke giver et endeligt bevis for direkte interaktion, co-lokalisering af proteiner i celler viser, at de omgruppere til stedet for skader og kan informere om rækkefølgen af begivenheder, der kræves for kompleks dannelse. Omhyggelig analyse af foci rumlige overlapning i celler, der udtrykker vilde type eller mutant versioner af et protein kan give dyrebare spor på funktionelle domæner vigtigt for DNA reparation funktion. Sidst, co-lokalisering af proteiner indikerer mulige direkte interaktioner, der kan verificeres ved co-immunoprecipation i celler, eller direkte pulldown ved hjælp af rensede proteiner.

Introduction

Menneskelige celler er konstant udsat for en række DNA skadelige stoffer af forskellig oprindelse. Eksogene kilder består for det meste af eksponering for stråling, kemikalier (herunder kemoterapeutiske midler og visse antibiotika) og virus, mens de vigtigste endogene kilder omfatter fejl i DNA-replikation og oxidativt stress. De direkte virkninger af genotoksisk eksponering kan variere fra en modificeret base til en potentielt dødelig DNA dobbelt-streng pause (DSB), afhængigt af stress og eksponeringsdosis. I sidste ende, urepareret eller fejlrepareret DNA-skader kan føre til ophobning af mutationer, genomiske rearrangements, genom ustabilitet og i sidste ende føre til carcinogenese¹. Pattedyrceller har udviklet komplekse veje til at genkende specifikke typer af^{DNA-skader 2,,3} og reparere dem i tide, synkroniseret med cellecyklus progression.

Iioniserende stråling (IR) skader DNA dobbelt helix og skaber dobbelt-streng pauser (DSBs), en af de mest skadelige former for DNA-skader. MRN (MRE11, RAD50, NBS1) kompleks fungerer som en sensor af DNA ender og aktiverer protein kinase ataxia telangiectasia muteret (ATM)^4,5. Efter den første aktivering af ATM ved DNA ender, ATM udløser en kaskade af DDR begivenheder på det sted, hvor pausen, indlede med en vigtig begivenhed, fosforylering af histone variant H2AX⁶. H2AX-fosforylering på restprodukt S139 aktiverer det i γH2AX, der spænder over områder op til megabaser omkring DNA-læsionen^6,7,8,9. Denne hændelse øger DNA-tilgængeligheden, hvilket fører til rekruttering og akkumulering af andre DNA-reparationsproteiner⁷. Fordi γH2AX er rigeligt og specifikt induceret omkringliggende DSBs, det kan let visualiseres ved hjælp af specifikke antistoffer, og er almindeligt anvendt som en surrogat markør for DSBs i DNA reparation området. Når bruddet er signaleret, celler aktivere deres DNA reparation veje og behandle DNA-skader. Proteinet MDC1 (mægler af DNA-skader checkpoint protein 1) binder direkte γH2AX¹⁰, interagerer med ATM¹¹ og også med NBS1^12,13. Det bidrager til at øge koncentrationen af MRN-komplekset i DSB og indleder et positivt atm-feedback-loop. γH2AX fjernes hurtigt, når bruddet er repareret, hvilket gør det muligt at overvåge DSB-frigangen. Efterfulgt af mikroskopi giver faldet i γH2AX over tid en indirekte måling af resterende brud og DNA-reparationseffektivitet.

Eukaryote celler kan reparere DSBs ved flere veje, de to vigtigste er ikke-homologe end-sammenføjning (NHEJ) og homolog rekombination (HR) (Figur 1). NHEJ i det væsentlige ligaerer DNA dobbelt-streng ender uden brug af udvidet homologi og opererer i hele celle^{cyklus 14,15}. HR bliver fremherskende i S- og G2-faser, og undertrykkes ellers, da det kræver en søsterkromet som en homolog skabelon til reparation^14,16. Pathway valg mellem NHEJ og HR ikke kun afhænger af den fysiske nærhed af søsterchromatid, men også af udvidelsen af DNA ende resektion¹⁷, som hæmmer NHEJ.

Homologi-afhængige DSB reparation initiere ved nukleolytisk nedbrydning af 5 ‘streng fra pausen ender til at generere 3 ‘single-streng DNA (ssDNA) haler, en proces benævnt 5’-3 ‘resektion. MRN-komplekset indleder DNA-slutresektion, og yderligere resektion behandles i kombination med BLM/EXO1 (Bloom syndrom protein/exonuclease 1) eller BLM/DNA2 (DNA replikation ATP-afhængig helicase/nuklease)^{18,19,20,21,22}. DNA-slutresektion forstærkes af CtIP (CtBP-interagerende protein) gennem dets direkte interaktion med MRN-kompleks²³ og rekruttering af BRCA1 (brystkræfttype 1 modtagelighedsprotein)^24,25. Replikering protein A (RPA) straks binder sig til ssDNA eksponeret og derefter fordrevet af recombinase protein RAD51 til at danne en nukleoprotein glødetråd, der katalyserer homolog søgning og strand invasion^26,27,28.

Indledningen af resektion er et kritisk skridt for reparation pathway valg. Når resektion er indledt, DNA ender bliver fattige substrater til binding af Ku70/Ku80 heterodimer (komponent af NHEJ vej) og celler er forpligtet til HR^17,,29,30. Den Ku70/Ku80 heterodimer binder sig til DSB ender, rekruttere DNA-pc’er og p53 Bindende Protein 1 (53BP1)^29,30. 53BP1 fungerer som en hindring for resektion i G1 og blokerer således HR og fremmer samtidig NHEJ^31,32, men fjernes på en BRCA1-afhængig måde i S-fasen , hvilket gør det muligt at genskrive^33,34. Derfor spiller 53BP1 og BRCA1 modsatrettede roller i DSB-reparationen, hvor 53BP1 er NHEJ-facilitator, mens BRCA1 handler, der gør det muligt at reparere gennem HR.

I laboratoriet kan DSB-formationen induceres ved iioniseringsstråling (IR). Mens dette eksempel udnytter en høj dosis på 4 Gy, 1 Gy og 2 Gy også skabe en betydelig mængde af DSBs, egnet til analyse af foci dannelse af rigelige proteiner. Det er vigtigt at bemærke, at den anvendte type og dosis af stråling kan føre til forskellige læsioner i DNA og i cellen: mens IR inducerer DSBs, kan det også forårsage enkelt streng pauser eller base modifikation (se^35,36 for en reference på bestråling lineær energioverførsel (LET) og type DNA-skader). For at bestemme kinetik af iionizing stråling-induceret foci (IRIF) dannelse og deres clearance, som indikerer reparation af skader og tilbageførsel af den aktiverede DDR^8,9^,37,38, foci dannelse kan overvåges på forskellige tidspunkter efter iionizing stråling.⁹ Timing af aktivering og clearance af alle større DNA-skader proteiner er kendt³⁹, og mange er undersøgt som surrogat markører for vigtige begivenheder. For eksempel, pRPA, som har høj affinitet for ssDNA bruges som et surrogat for pause resektion, MRN proteiner (MRE11, RAD50, NBS1) og exonucleaser kan bruges til at vurdere resektion effektivitet også. Mens RAD51, BRCA1, BRCA2 (brystkræft type 2 modtagelighed protein), og PALB2 (partner og localizer af BRCA2) kan overvåges for at evaluere HR effektivitet, tilstedeværelsen af Ku proteiner eller 53BP1, anvendes som markører for NHEJ (Figur 1).

Som proteiner af DNA reparation maskiner rekruttere hinanden til pause og samle i super-komplekser, DNA-protein og protein-protein interaktioner kan udledes ved at følge deres individuelle lokalisering over tid og analysere co-lokalisering af proteiner, som visualiseret af overlappende signaler i celle^40,41,42. I cellelinjer giver indførelsen af punktmutationer eller sletning i specifikke DNA-reparationsgener enten gennem genomredigering eller ved overekspression af plasmidbaserede mutanter mulighed for undersøgelse af specifikke restkoncentrationer og deres mulige rolle i genkendelse af DNA-skader (f.eks. co-lokalisering med γH2AX) eller kompleks samling (sam lokalisering med en anden eller flere proteiner) samt deres indvirkning på DNA-reparationen. Her bruger vi indirekte immunfluorescens som et middel til at undersøge dannelsen og opløsningen af DSB’er ved at følge γH2AX foci over tid. Vi præsenterer også et eksempel på foci formation og co-lokalisering analyse af en stor aktør i DSB reparation: p53 Bindende Protein 1 (53BP1)³². Som tidligere nævnt, 53BP1 anses for centralt for DNA reparation pathway valg. Efter 53BP1 ophobning og dens co-lokalisering med γH2AX giver værdifulde oplysninger om celle cyklus fase, DNA-skader ophobning, og vej bruges til at reparere DSBs. Formålet med indirekte immunolokalkisering er at vurdere effektiviteten af DNA-skade reparation i cellelinjer, efter IR som i denne undersøgelse, eller efter eksponering for forskellige belastninger i celle, fra DNA crosslinking til blokering af replikation gaffel (en liste over DNA skadelige stoffer er fastsat i tabel 1).

Figur 1: DNA dobbelt streng pauser (DSB) reparation veje.
DSB reparation indebærer to store veje: Homolog rekombination (HR, venstre) og ikke-homologe End-Joining (NHEJ, højre). Efter pausen aktiveres proteiner for at markere bruddet (γH2AX), deltager i slutresektionen (MRN), belægger den resected ssDNA (pRPA), fremmer rekombination (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) eller begrænser resektion og fremmer NHEJ (53BP1). Andre proteiner deltager i skadesreparation, men de anførte proteiner efterfølges rutinemæssigt af indirekte immunfluorescens. Klik her for at se en større version af dette tal.

DNA-skademiddel	Virkningsmekanisme	Anbefalet dosis
γ-stråler/røntgenstråler	Stråling Dannelse af dobbeltstrengede brud med nogle ukontrollerede cellulære effekter	1-4 Gy
kr. Ar ioner	Stråling Dannelse af dobbeltstrengede pauser	270 keV/μm
α-partikler	Stråling Dannelse af dobbeltstrengede pauser	116 keV/μm
Bleomycin	Hæmmer af DNA-syntese	0,4-2 μg/ml
Camptothecin	Hæmmer af topoisomerase I	10-200 nM
Cisplatin	Alkylerende middel (inducerende intrastrand krydslinks)	0,25-2 μM
Doxorubicin	Intercaleringsmiddel Hæmmer af topoisomerase II	10-200 nM
Etoposide	Hæmmer af topoisomerase II	10 μM
Hydroxyurea	Hæmmer af DNA-syntese (ved ribonucleotid reduktase)	10-200 μM
Methylmethanulfonat	Alkylerende middel	0,25-2 mM
Mitomycin C	Alkylerende middel	0,25-2 μM
Ultraviolet (UV) lys	Dannelse af thymidindæmpere (genererer forvrængning af DNA-kæden)	50-100 mJ/cm2

Tabel 1: Genotoksiske midler. Eksempler på DNA-skadelige stoffer, deres virkningsmekanisme og de skader, der er forårsaget på grundlag af foreslået arbejdskoncentration.

Protocol

1. HeLa celle kultur Forbehandl rund glasdæksler med 1 M HCl ved 50 °C i 16-18 timer. Skyl med ddH2O og opbevares i 100% EtOH. Forbered cellekulturmedium: Tilføj 10% (v/v) FBS til DMEM-mediet. Vokse 4,0 x 104 celler / godt i sterile 12-brønd plade med en 18 mm rund glas coverslip ved 37 °C og 5% CO2 i en befugtet inkubator. Dyrk celler til 80% sammenløb (ca. 24 timer). 2. Cellebehandling med stråling (IR) For…

Representative Results

På dag 2, eller 24 timer efter såning celler på coverslips, celler har gennemgået en division og er 80% sammenløb. Specifikke knock downs eller mutationer i DNA reparation proteiner kan øge fordobling tid, eller sensibilisere celler til genotoksisk behandling, og såning tæthed samt behandling doser bør justeres i overensstemmelse hermed. For at bestemme de bedste arbejdsforhold kan tidspunktet for DNA-skadesresponsen bestemmes ved vestlig blotting af γH2AX over tid, og følsomhed over for bestråling kan identi…

Discussion

Analyse af timingen og effektiviteten af DNA-skader reparation ved mikroskopi har vist sig afgørende for at forstå, hvordan DNA reparation maskiner funktioner, i normale celler og i menneskelige patologier såsom kræft.

Udviklingen af specifikke antistoffer, der gør det muligt at detektionere aktiverede proteiner i deres fosforylerede version (såsom γH2AX, pRPA, pRAD50 og andre^{10,,23,39,</s…}

Materials

16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	15710	Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use.
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background.
Coverglass #1, 18 mm round (coverslips)	Neuvitro	NC0308920	Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol.
DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate]	Gibco	11965118	Adjust the growing media to the needs of cell line used.
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	PBS for tissue culture.
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Research Products International	E57060	Nuclear extraction buffer.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	104370028	The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress.
Magnesium chloride (MgCl2)	Research Products International	M24000	Nuclear extraction buffer.
Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES)	Research Products International	P40150	Nuclear extraction buffer.
SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	S36973	300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead.
Sodium chloride (NaCl)	Research Products International	S23020	Nuclear extraction buffer.
Sucrose	Research Products International	S24060	Nuclear extraction buffer.
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisherbrand	1255015	Polysine Slides can be used instead.
TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells	Costar	3513	Seeding on coverslips is done in 12-wells plate.
Triton X-100	AmericanBio	AB02025	Nuclear extraction buffer.
TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red	Gibco	12604021	Trypsin-EDTA can be used instead.
Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red	Gibco	15400054	TrypLE can be used instead.