الكشف عن الحمض النووي خالية من الخلايا في عينات بلازما الدم من مرضى السرطان

Summary

في هذه الورقة نقدم بروتوكول مفصل لتقنية خزعة السائل غير الغازية، بما في ذلك جمع الدم، البلازما وفصل معطف بافي، استخراج CFDNA والحمض النووي الجرثومي، وتحديد كم CFDNA أو الحمض النووي الجرومي، وتحليل إثراء جزء CFDNA.

Abstract

تحديد الطفرات في أورام مرضى السرطان هو خطوة هامة جدا في إدارة الأمراض. هذه الطفرات بمثابة المؤشرات الحيوية لتشخيص الورم وكذلك لاختيار العلاج واستجابته في مرضى السرطان. الطريقة القياسية الذهبية الحالية للكشف عن الطفرات الورم ينطوي على اختبار وراثي للحمض النووي الورم عن طريق خزعات الورم. ومع ذلك، من الصعب إجراء هذه الطريقة الغازية بشكل متكرر كاختبار متابعة لذخيرة الورم الطفرة. خزعة السائل هو أسلوب جديد وناشئ للكشف عن الطفرات الورمية باعتبارها سهلة الاستخدام وغير الغازية نهج الخزعة.

الخلايا السرطانية تتكاثر بسرعة. بالتوازي، العديد من الخلايا السرطانية تخضع لتخثر الدم. يتم إطلاق الحطام من هذه الخلايا في نظام الدورة الدموية للمريض ، جنبا إلى جنب مع قطع الحمض النووي المجزأة بشكل دقيق ، تسمى شظايا الحمض النووي الخالية من الخلايا (CFDNA) ، والتي تحمل طفرات الحمض النووي الورم. لذلك ، لتحديد المؤشرات الحيوية القائمة على عقود زعنف نا باستخدام تقنية خزعة سائلة ، يتم جمع عينات الدم من مرضى السرطان ، يليها فصل البلازما والمعطف البافي. بعد ذلك ، تتم معالجة البلازما لعزل cfDNA ، ويتم معالجة المعطف الماطفي الخاص به لعزل الحمض النووي الجينومي للمريض. ثم يتم فحص كل من عينات الحمض النووي لكمية ونوعية؛ وتحليلها للطفرات باستخدام الجيل التالي من تقنيات التسلسل (NGS).

في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول مفصل للخزعة السائلة، بما في ذلك جمع الدم، والبلازما، وفصل المعطف البافي، واستخراج الحمض النووي لثنائي cfDNA والجراثيم، وتحديد كمية الحمض النووي للحمض النووي باستخدام الـCFDNA أو الحمض النووي الجرثومي، وتحليل الإثراء لشظايا cfDNA.

Introduction

وقد أدت التطورات التكنولوجية إلى تسلسل مئات من الجينوم السرطان و النسخ¹. وقد ساهم هذا في فهم المناظر الطبيعية للتغيرات الجزيئية عبر أنواع السرطان المختلفة². وقد ساعدت دراسات أخرى على هذه المناظر الطبيعية تميز التعديلات الجسدية المتتابعة والانصهار الجيني³ التي تشارك في السرطان أو تطور الورم ، عن طريق تعطيل مسارات الخلايا المبرمجة تسلسليا⁴. ولذلك، يمكن أن الطفرات الجسدية وندمج الجينات الجينات تقديم معلومات حول الأورام من خلال العمل كعلامات حيوية في المرضى الفردية لنوع معين من الورم⁵، وتحديد الأورام الأولية القائمة التكهن⁶، تصنيف الأورام الثانوية على أساس التغيرات الجزيئية⁷، وتحديد أهداف الورم القابلة للأدوية⁸. قد تسهل هذه المعلومات في اختيار العلاج المخصص لمرضى السرطان وفي تحديد ردود إيجابية وسلبية العلاج⁹. ومع ذلك، الحصول على مواد الورم لتحديد التنميط الجينومي للأنسجة الورم هو إجراء الغازية¹⁰. وعلاوة على ذلك, خزعة الورم لا تشمل سوى جزء صغير من ورم غير متجانسة; ويجوز لذلك، لا يكون ممثلا للملامح الجزيئية للورم كله¹¹. يتطلب الرصد المتسلسل والورم genotyping مجموعة متكررة من أنسجة الورم ، والتي ، عادة ، غير مجدية بسبب غزو إجراء خزعة الورم وقضايا السلامة التي تنشأ عن مثل هذه الإجراءات¹².

تقنية خزعة السائل، من ناحية أخرى، وقد اكتسبت اهتماما هائلا في علم الأورام الدقة على مدى العقد الماضي^13،14. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم الغازية من هذه التقنية، وإمكانية تكرار ذلك في نقاط زمنية متعددة، مما يتيح تقنية سهلة الاستخدام وآمنة لرصد دورات المرض^15،16. تعتمد الخزعة السائلة على ظاهرة تتكاثر فيها الخلايا السرطانية بسرعة ، وفي نفس الوقت يخضع العديد منها للتخثر والناخر. وهذا يؤدي إلى إطلاق حطام الخلايا المبرمج في دم المرضى ، جنبا إلى جنب مع شظايا الحمض النووي التي يتم قطعها بأحجام دقيقة خلال المبرمج^17. إن موت الخلايا غير السرطانية يؤدي أيضاً إلى إطلاق حطامها الخلوي في الدم، ومع ذلك، فإن معدل موت الخلايا المبرمج في هذه الخلايا أقل بكثير نسبياً من الخلايا السرطانية¹⁸. عقلاني من تقنية خزعة السائل هو التقاط الجزيئات المرتبطة بالورم مثل الحمض النووي, RNA, البروتينات, والخلايا السرطانية^14,19 التي تدور باستمرار في الدم. تقنيات مختلفة²⁰ يمكن استخدامها لتحليل هذه الجزيئات بما في ذلك الجيل التالي التسلسل (NGS)، الرقمية القطيرة البوليميراز سلسلة التفاعل (DdPCR)، PCR في الوقت الحقيقي، والمناعة المرتبطة الانزيم المقايسة (ELISA). تقنية خزعة السائل تمكن تحديد المؤشرات الحيوية التي هي خصائص الخلايا السرطانية. هذه الجزيئات العلامات الحيوية ليست فقط إطلاقها من أجزاء محددة من الورم، ولكن بدلا من جميع أجزاء الورم²¹. وبالتالي، علامات محددة في خزعة السائل يمثل التنميط الجزيئي للورم غير متجانسة بالكامل، بالإضافة إلى الأورام الأخرى في الجسم، وبالتالي، وجود مزايا على الأنسجة على أساس تقنية^22.

وcfDNA لديه فترة قصيرة نصف العمر في الدم المتداولة تتراوح بين بضع دقائق إلى 1-2 ساعة²³. ومع ذلك، فإن فترة نصف العمر القصيرة لـ cfDNA تسهل إجراء التحليلات في الوقت الحقيقي من خلال تقييم استجابة العلاج وتقييمات الورم الديناميكية. تشير مستويات cfDNA المشتقة من الورم إلى التكهن بمرحلة الورم / حجمها الذي أظهرته العديد من الدراسات ، والتي أظهرت وجود علاقة بين مستويات CFDNA ونتائج البقاء على قيد الحياة²⁴. وعلاوة على ذلك، أثبتت الدراسات أن CFDNA لديه قدرة تنبؤ أفضل من علامات الورم الموجودة²⁵. التكهن من cfDNA هو أكثر وضوحا بعد علاج السرطان, مستويات أعلى من cfDNA بعد العلاج يرتبط بشكل جيد مع انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة, ومقاومة للعلاج. في حين, انخفاض مستويات cfDNA بعد العلاج يتوافق عموما مع استجابة إيجابية للعلاج. وبالإضافة إلى ذلك، ييسر نظام cfDNA الكشف المبكر عن الاستجابة للعلاج من طرق الكشف التقليدية.

وcfDNA يزيد من إمكانية الكشف المبكر عن الطفرات المرتبطة بالسرطان: خلال مرحلة مبكرة من المرض¹⁵, بداية الأعراض²⁶ وقبل تشخيص السرطان تصل إلى 2 سنة²⁷. كما يتم الافراج عن cfDNA من مناطق أو بؤر متعددة الورم، وتحليلها يوفر نظرة شاملة للجينوم الورم أنه يمثل²⁸. ولذلك، فإن cfDNA تمكن من الكشف عن الطفرات الجسدية التي قد غاب في عينات الأنسجة²⁹. كما يمكن الكشف عن التغايرية داخل الورم والطفرات تحت النسيلة عن طريق التسلسل العميق للمناطق الجينومية التي تمتد على آلاف القواعد، وبالتالي فإن تحليل cfDNA تمكن من الكشف عن أنواع فرعية جزيئية محددة مع تواقيع الجينومية المتميزة¹³. للحصول على مستوى مماثل من المعلومات من خلال عينة الأنسجة كان هناك حاجة إلى العديد من الخزعات الصلبة.

وعلاوة على ذلك، فإن مستويات cfDNA في المرضى الذين يعانون من مرض محلي مثل القولون, المبيض, وسرطان الرئة بعد العلاج الجراحي و / أو العلاج الكيميائي, أظهرت أن علامة قوية التكهن لتكرار السرطان ونتائج العلاج²⁰. وعلاوة على ذلك، في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والثدي والرئة، يمكن لتحليلات cfDNA من الدم الكشف بنجاح عن التغيرات الورم محددة، مما أدى إلى التنبؤ الدقيق لتكرار عدة أشهر مقدما¹³. وعلاوة على ذلك, علامات المقاومة العلاج, مثل الطفرات KRAS في المرضى الذين يعانون من CRC تلقي العلاج المضاد EGFR³⁰; VAFs للجينات مثل PIK3CA, MED1 أو EGFR في المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي بعد العلاج مع العلاجات المختلفة³¹; وEGFR T790M المقاومة الطفرة في سرطان الرئة المرضى الذين عولجوا مع المعارف التقليدية التي تستهدف EGFR^يمكن أيضا تحديدها من خلال تحليل cfDNA.

باختصار، تحليل cfDNA يمكن أن تستخدم لتحديد المؤشرات الحيوية الدقيقة في مجال الأورام^13،33. في هذا البروتوكول، تمت معالجة عينات دم من 3 مرضى الورم الدبقي و 3 ضوابط صحية للحصول على الحمض النووي الجينومي من WBCs وCFDNA من البلازما. في سرطان الورم الدبقي، والطفرات في IDH، TERT، ATRX، EGFR، وTP53 بمثابة علامات التشخيص وكذلك التكهن التي قد تساعد في التشخيص المبكر للأورام الدبقية، وتصنيف أنواع مختلفة من الأورام الدبقية، وتوجيه العلاج الدقيق للمريض الفرد وفهم استجابة العلاج^34،35. يمكن تحديد الحالة الطفرة لهذه الجينات باستخدام CFDNA المستمدة من الدم. في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول مفصل من cfDNA المشتقة من البلازما التي تم استخدامها لدراسة التغيرات الطفرة في سرطان الورم الدبقي¹². مثل هذا بروتوكول خزعة السائل المستندة إلى cfDNA الموضح في هذه المقالة يمكن استخدامه لدراسة التغيرات الطفرة في العديد من أنواع السرطان الأخرى. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة حديثة أن خزعة السائل المستندة إلى CFDNA يمكن الكشف عن 50 نوعا مختلفا من^{السرطانات 36}.

جمع عينات الدم وتخزينها وشحنها هي خطوات حاسمة في هذا البروتوكول، حيث أن درجة الحرارة غير المنضبطة خلال هذه الخطوات تتسبب في تحلل مراكز حماية الملوثات البرية ، مما يؤدي إلى إطلاق الحمض النووي الجينومي من WBC في البلازما والتسبب في تلوث عينة cfDNA ، مما يؤثر على بقية الإجراء³⁷. يمكن أن ينكمز الانحلال بسبب درجة الحرارة غير المنضبطة عمليات إعداد عينة المصب من cfDNA، مثل خطوات PCR³⁸. يحتوي المصل على نسبة عالية من cfDNA الخط الجرثومي بدلاً من البلازما ، على الرغم من أنه يقدم ضوضاء خلفية كبيرة لـ cfDNA المرتبطة بالورم³⁹. ولذلك، لعزل cfDNA المرتبطة بالورم، البلازما هي عينة مناسبة³⁹. وينبغي طرد الدم المسحوب في مضاد للتخثر يحتوي على أنبوب جمع الدم على الفور أو في غضون ما يصل إلى ساعتين، لفصل البلازما وتجنب التلوث بcfDNA. في هذا البروتوكول، يتم استخدام أنابيب جمع الدم CFDNA التجارية المخصصة (انظر جدول المواد)، والتي هي بديل لتخثر الدم التي تحتوي على أنابيب جمع الدم. هذه الأنابيب المخصصة لجمع الدم تحافظ على CFDNA و CFRNA ، وتمنع تحلل WBCs لمدة تصل إلى 30 يومًا في درجة الحرارة المحيطة ، وما يصل إلى 8 أيام عند 37 درجة مئوية. وهذا يسهل الحفاظ على درجة الحرارة المناسبة أثناء شحنة عينة الدم وحتى يتم فصل البلازما وWBC⁴⁰.

هناك ثلاثة أنواع من منهجيات استخراج cfDNA المتاحة حاليا: عزل المرحلة، السيليكون غشاء محور العمود، والعزلة المغناطيسية القائمة على الخرز⁴¹. وأسفرت طريقة عمود الدوران القائم على غشاء السيليكون عن كمية عالية من cfDNA مع سلامة عالية مقارنة مع أساليب استخراج cfDNA الأخرى⁴².

التقييم الكمي للحمض النووي هو شرط أساسي في خزعة السائل، وهناك حاجة لتطوير بسيطة، بأسعار معقولة، وإجراء موحدة لتنفيذها سهلة والاستخدام على نطاق واسع. ثلاث طرق شائعة الاستخدام لقياس كمي cfDNA هي القياس الطيفي، الفلوريمترية، و qPCR. وثبت أن الأسلوب الفلوريمتري أفضل من الطرق الأخرى المتعلقة بدقة وتكلفة وسهولة إجراء⁴³.

يمكن تقدير سلامة ونقاء cfDNA إما بواسطة الأجاجوز الكهربائي أو الكهربائي الشعري. Agarose electrophoresis لا يظهر حساسية في تركيز منخفض من cfDNA ولا دقة عالية لإظهار حجم جزء دقيق من cfDNA. من ناحية أخرى، الكهربائي الشعري لديه ميزة على الكهربائي agarose من خلال التغلب على التحديات المرتبطة بها، وبالتالي، تستخدم على نطاق واسع من قبل الباحثين لتحليل حجم الجزء cfDNA. في هذا البروتوكول، تم تقدير توزيع حجم جزء من cfDNA معزولة باستخدام أداة كهربائية شعرية آلية (انظر جدول المواد).

Protocol

قبل جمع الدم، يجب الحصول على موافقة مستنيرة من الأشخاص المشاركين في البحث ويجب الحصول عليها. تم إجراء البحث الموصوف في هذه المخطوطة وفقاً والامتثال لمركز رابين الطبي، ولجنة أخلاقيات إسرائيل (رمز الأخلاقيات: 0039-17-RMC) وكلية الطب دير كريستيان-ألبريخت-Universität zu كييل، لجنة أخلاقيات ألمانيا (رمز …

Representative Results

فصل البلازما8.5-9 مل الدم التي تم جمعها في cfDNA أو CFRNA أنابيب المواد الحافظة تسفر عن حوالي ~ 4 مل البلازما في الحجم. قد يختلف حجم البلازما المنفصلة عن الدم الذي يتم جمعه في أنابيب EDTA وفقًا لدرجة الحرارة. التعرض لأنابيب EDTA التي تحتوي على الدم في درجة حرارة أعلى من 37 درجة مئوية يؤدي إلى ا…

Discussion

جمع دم المريض في أنبوب, شحنة وتخزين الخطوات الأولية الحاسمة في خزعة السائل. يمكن أن تعيق المعالجة غير السليمة جودة البلازما ، وبالتالي ، يمكن أن تتداخل مع نتائج خزعة السائل⁴⁷. إذا تم جمع عينة دم في أنبوب الدم EDTA، يجب فصل البلازما في غضون ساعتين من جمع الدم لتجنب تحلل من WBCs وإطلاق…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C