Påvisning af cellefri DNA i blodplasmaprøver af kræftpatienter

Summary

I dette papir præsenterer vi en detaljeret protokol for ikke-invasiv flydende biopsi teknik, herunder blodopsamling, plasma og buffy pels adskillelse, cfDNA og kimbar DNA ekstraktion, kvantificering af cfDNA eller kim kim DNA, og cfDNA fragment berigelse analyse.

Abstract

Identifikation mutationer i tumorer af kræftpatienter er et meget vigtigt skridt i sygdomshåndtering. Disse mutationer tjene som biomarkører for tumor diagnose samt for behandling udvælgelse og dens reaktion hos kræftpatienter. Den nuværende guld standard metode til påvisning af tumor mutationer indebærer en genetisk test af tumor DNA ved hjælp af tumor biopsier. Denne invasive metode er imidlertid vanskelig at udføre gentagne gange som en opfølgningstest af tumormutationsrepertoiret. Flydende biopsi er en ny og spirende teknik til påvisning af tumormutationer som en brugervenlig og ikke-invasiv biopsi tilgang.

Kræftceller formere sig hurtigt. Sideløbende gennemgår mange kræftceller apoptose. Snavs fra disse celler frigives i en patients kredsløbssystem sammen med fint fragmenterede DNA-stykker, kaldet cellefri DNA (cfDNA) fragmenter, som bærer tumor-DNA-mutationer. Derfor indsamles der blodprøver fra kræftpatienterne til identifikation af cfDNA-baserede biomarkører ved hjælp af flydende biopsiteknik efterfulgt af adskillelse af plasma og buffy coat. Dernæst behandles plasma til isolering af cfDNA, og den respektive buffy frakke behandles til isolering af en patients genomiske DNA. Begge nukleinsyreprøver kontrolleres derefter for deres mængde og kvalitet; og analyseres for mutationer ved hjælp af næste generations sekventeringsteknikker (NGS).

I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret protokol for flydende biopsi, herunder blodsamling, plasma og buffy coat separation, cfDNA og kim-DNA-ekstraktion, kvantificering af cfDNA eller kim-DNA og cfDNA fragmentberigelsesanalyse.

Introduction

Teknologiske fremskridt har ført til sekventering af hundredvis af kræftgenomer og transskriptioner¹. Dette har bidraget til at forstå landskaber af molekylære ændringer på tværs af forskellige kræfttyper². Yderligere undersøgelser af disse landskaber har hjulpet med at karakterisere de sekventielle somatiske ændringer og gengenfusioner^3, der er involveret i kræft eller tumorprogression, ved serielt at forstyrre apoptoseveje⁴. Derfor kan somatiske mutationer og gen-genfusioner give oplysninger om tumorer ved at tjene som biomarkører hos individuelle patienter for en bestemt tumortype⁵, identificere eksisterende primære tumorer prognose⁶, kategorisere sekundære tumorer baseret på molekylære ændringer⁷og identificere druggable tumormål⁸. Sådanne oplysninger kan gøre det lettere at vælge personlig behandling af kræftpatienter og ved bestemmelse af positive og negative behandlingsresponser⁹. Men at opnå tumormateriale til identifikation af genomisk profilering af tumorvæv er en invasiv procedure¹⁰. Desuden, en tumor biopsi omfatter kun en lille del af en heterogen tumor; og kan derfor ikke være repræsentativ for den molekylære profil af hele^{tumoren 11}. Seriel overvågning og tumor genotyping kræver en gentagen samling af tumorvæv, hvilket normalt ikke er muligt på grund af invasiviteten af tumorbiopsiproceduren og de sikkerhedsproblemer, der opstår ved sådanne procedurer¹².

Den flydende biopsi teknik, på den anden side, har fået enorm opmærksomhed i præcision onkologi i løbet af det sidste årti^13,14. Det skyldes hovedsageligt denne tekniks ikke-invasivitet og muligheden for, at den gentages på flere tidspunkter, hvilket muliggør en brugervenlig og sikker overvågningsteknik til sygdomskurserne^15,16. Flydende biopsi er baseret på et fænomen, som tumorceller formere sig hurtigt, og samtidig mange af dem gennemgår apoptose og nekrose. Dette fører til frigivelse af apptotisk cellerester i patienternes blod sammen med de DNA-fragmenter, der skæres i præcise størrelser under apoptose¹⁷. Apoptose af ikke-kræftceller fører også til frigivelse af dets cellulære snavs i blodet, men apoptosehastigheden i disse celler er relativt meget lavere end tumorceller¹⁸. Rationalet i den flydende biopsiteknik er at fange tumorrelaterede molekyler som DNA, RNA, proteiner og tumorceller^14,19, der cirkulerer kontinuerligt i blodet. Forskellige teknikker²⁰ kan bruges til analyse af disse molekyler, herunder next-generation sekventering (NGS), digital dråbe polymerase kædereaktion (ddPCR), real-time PCR, og enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA). Flydende biopsi teknik gør det muligt at identificere biomarkører, der er kendetegnende for tumorceller. Disse biomarkørmolekyler frigives ikke kun fra specifikke dele af en tumor, men snarere fra alle dele af tumoren²¹. Derfor repræsenterer markører identificeret i flydende biopsi den molekylære profilering af en hel heterogen tumor, ud over andre tumorer i kroppen, og har således fordele i forhold til vævsbiopsibaseret teknik²².

CFDNA har en kort halveringstid i det cirkulerende blod fra et par minutter til 1-2 timer²³. Den korte halveringstid for cfDNA letter imidlertid realtidsanalyser ved at evaluere behandlingsrespons og dynamiske tumorvurderinger. Den tumor-afledte cfDNA niveauer indikerer prognostication af tumor fase / størrelse fremgår af flere undersøgelser, som viste en sammenhæng mellem cfDNA niveauer og overlevelse resultater²⁴. Desuden har undersøgelser vist, at cfDNA har en bedre forudsigelseskapacitet end eksisterende tumormarkører²⁵. Prognosen for cfDNA er endnu mere udtalt efter kræftbehandling, højere niveauer af cfDNA efter behandling korrelerer godt med en reduceret overlevelsesrate og modstand mod behandling. Mens lavere niveauer af cfDNA efter behandling generelt svarer til positiv behandlingsrespons. Derudover letter cfDNA tidlig påvisning af behandlingsrespons end de traditionelle detektionsmetoder.

CFDNA øger muligheden for tidlig påvisning af kræftrelaterede mutationer: i den tidlige fase sygdom¹⁵, symptomernes begyndelse²⁶ og før kræftdiagnose op til 2 år²⁷. Da cfDNA frigives fra flere tumorregioner eller foci, giver dens analyse et omfattende overblik over tumorgenomet, det repræsenterer²⁸. Derfor gør cfDNA det muligt at opdage somatiske mutationer, der kan være gået glip af i vævsprøverne²⁹. Som intra-tumor heterogenitet og subklonale mutationer kan påvises ved dyb sekventering af genomiske regioner spænder over tusindvis af baser, derfor analysen af cfDNA gør det muligt at afdække specifikke molekylære undertyper med forskellige genomiske signaturer¹³. For at opnå et tilsvarende niveau af information gennem vævsprøve mange faste biopsier ville have været nødvendig.

Desuden cfDNA niveauer hos patienter med en lokaliseret sygdom som tyktarm, æggestokkene, og lungekræft efter en kirurgisk behandling og / eller kemoterapi, viste sig at være en kraftig prognostisk markør for kræft tilbagefald og behandlingsresultater²⁰. Desuden, hos patienter med tyktarms-, bryst- og lungekræft, kunne analyser af cfDNA fra blodet med succes opdage de tumorspecifikke ændringer, hvilket førte til den præcise forudsigelse af gentagelse flere måneder i forvejen¹³. Endvidere behandlingsresistensmarkørerne, såsom KRAS-mutationer hos patienter med CRC, der modtager anti-EGFR-behandling^30; VAF for gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos patienter med brystkræft efter behandling med forskellige behandlingsformer³¹; og EGFR T790M resistensmutation hos lungekræftpatienter behandlet med EGFR-målrettede TKIs³² kan også identificeres ved cfDNA-analyse.

Kort sagt kan cfDNA-analysen bruges til at identificere præcise biomarkører inden for onkologi^13,33. I denne protokol blev blodprøver af 3 gliompatienter og 3 sunde kontroller behandlet for at opnå genomisk DNA fra WBCs og cfDNA fra plasmaet. I glioma cancer fungerer mutationer i IDH, TERT, ATRX, EGFR og TP53 som en diagnostisk såvel som prognostiske markører, der kan hjælpe med tidlig diagnose af glioma tumorer, klassificere forskellige typer glioma tumorer, vejlede den nøjagtige behandling for den enkelte patient og forstå behandlingsresponset^34,35. Mutationsstatus for disse gener kan identificeres ved hjælp af blod-afledt cfDNA. I dette manuskript præsenterer vi en detaljeret protokol over plasma-afledt cfDNA, der er blevet brugt til at studere mutationsændringer i glioma cancer¹². En sådan cfDNA-baseret flydende biopsiprotokol forklaret i denne artikel kan bruges til at studere mutationsændringer i mange andre typer kræft. Desuden har en nylig undersøgelse vist, at cfDNA-baseret flydende biopsi kan detektere 50 forskellige typer kræft³⁶.

Blodprøveindsamling, opbevaring og forsendelse er afgørende trin i denne protokol, da ukontrolleret temperatur under disse trin forårsager lysis af WBC’er, hvilket fører til frigivelse af genomisk DNA fra WBC i plasmaet og forårsager forurening af cfDNA-prøven, hvilket påvirker resten af proceduren³⁷. Hæmolyse på grund af ukontrolleret temperatur kan forringe downstream prøveforberedelsesprocesserne for cfDNA, såsom PCR-trin³⁸. Serumet indeholder en høj andel af kim-cfDNA snarere end plasma, selv om det præsenterer en stor baggrundsstøj for tumor-associeret cfDNA³⁹. Derfor er plasma til isolering af tumorrelateret cfDNA en egnet prøve³⁹. Blod, der trækkes i et antikoagulerende middel, der indeholder blodopsamlingsrør, skal centrifuges straks eller inden for op til to timer for at adskille plasmaet og undgå cfDNA-kontaminering. I denne protokol anvendes dedikerede kommercielle cfDNA-konserveringsblodopsamlingsrør (se Materialetabel), som er et alternativ til antikoagulerende, der indeholder blodopsamlingsrør. Disse dedikerede blodopsamlingsrør bevarer cfDNA og cfRNA og forhindrer lysis af WBCs i op til 30 dage ved omgivelsestemperatur og op til 8 dage ved 37 °C. Dette gør det lettere at opretholde en passende temperatur under en blodprøveforsendelse, og indtil plasmaet og WBC adskilles⁴⁰.

Der findes i øjeblikket tre typer cfDNA-ekstraktionsmetoder: faseisolation, siliciummembranbaseret spinkolonne og magnetisk perlebaseret isolation⁴¹. Den siliciummembranbaserede spin-kolonnemetode gav en stor mængde cfDNA med høj integritet sammenlignet med andre cfDNA-ekstraktionsmetoder⁴².

Den kvantitative evaluering af DNA er et grundlæggende krav i flydende biopsi, der er behov for at udvikle en enkel, overkommelig og standardiseret procedure for deres nemme implementering og brede brug. Tre almindeligt anvendte metoder til cfDNA-kvantificering er spektrofotometrisk, fluormetrisk og qPCR. Den fluormetriske metode er bevist bedre i forhold til de andre metoder vedrørende nøjagtighed, omkostninger og letledning⁴³.

CFDNA’s integritet og renhed kan estimeres ved enten agaroseelektroforese eller kapillærelektroforese. Agarose elektrophoresis hverken viser følsomhed ved lav koncentration af cfDNA eller har høj opløsning til at vise præcis fragmentstørrelse af cfDNA. På den anden side har kapillær elektroforese en fordel i forhold til agaroseelektroforesen ved at overvinde de tilknyttede udfordringer og derfor i vid udstrækning anvendes af forskerne til cfDNA fragmentstørrelsesanalyse. I denne protokol blev fragmentstørrelsesfordelingen af isolerede cfDNA anslået ved hjælp af et automatiseret kapillærelektroforeseinstrument (se materialetabel).

Protocol

Forud for blodindsamling kræves informeret samtykke fra forsøgspersoner, der deltager i forskningen, og skal indhentes. Den forskning, der er beskrevet i dette manuskript, blev udført i overensstemmelse med og i overensstemmelse med Rabin Medical Center, Israels etikudvalg (etikkode: 0039-17-RMC) og Det Medicinske Fakultet Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Tysklands etikudvalg (etikkode: D 405/14). 1. Opsamling og opbevaring af blodprøver i cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrør</p…

Representative Results

Plasma adskillelse8,5-9 mL blod indsamlet i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddel rør giver omkring ~ 4 mL plasma i volumen. Mængden af plasma adskilt fra blod indsamlet i EDTA-rør kan variere afhængigt af temperaturen. Eksponering af EDTA-rør, der indeholder blod ved en temperatur på over 37 °C, fører til nedsat udbytte af plasmavolumen44. FluorometeranalyseresultatercfDNA-koncentrationen i 1 mL plasma hos hver af gliom…

Discussion

Indsamling af en patients blod i et rør, forsendelse og opbevaring er afgørende indledende skridt i flydende biopsi. Forkert håndtering kan forringe plasmaets kvalitet og kan derfor forstyrre resultaterne af den flydende biopsi⁴⁷. Hvis der opsamles en blodprøve i et EDTA-blodrør, skal plasmaet adskilles inden for to timer efter blodopsamlingen for at undgå lysis af WBCs og frigivelse af dets genomiske DNA i plasmaet⁴⁸. WBCs kan også gennemgå apoptose i et EDTA-rør,…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C