Detectie van celvrij DNA in bloedplasmamonsters van kankerpatiënten

Summary

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol voor niet-invasieve vloeibare biopsietechniek, waaronder bloedafname, plasma- en buffy coatscheiding, cfDNA- en kiembaan-DNA-extractie, kwantificering van cfDNA of kiembaan-DNA en cfDNA-fragmentverrijkingsanalyse.

Abstract

Het identificeren van mutaties in tumoren van kankerpatiënten is een zeer belangrijke stap in de ziektebestrijding. Deze mutaties dienen als biomarkers voor tumordiagnose en voor de behandelingsselectie en de respons ervan bij kankerpatiënten. De huidige gouden standaardmethode voor het detecteren van tumormutaties omvat een genetische test van tumor-DNA door middel van tumorbiopsieën. Deze invasieve methode is echter moeilijk herhaaldelijk uit te voeren als vervolgtest van het tumormutatierepertoire. Vloeibare biopsie is een nieuwe en opkomende techniek voor het detecteren van tumormutaties als een gebruiksvriendelijke en niet-invasieve biopsiebenadering.

Kankercellen vermenigvuldigen zich snel. Tegelijkertijd ondergaan tal van kankercellen apoptose. Puin van deze cellen komt vrij in de bloedsomloop van een patiënt, samen met fijn gefragmenteerde DNA-stukken, celvrije DNA-fragmenten (cfDNA) genoemd, die tumor-DNA-mutaties dragen. Daarom worden voor het identificeren van cfDNA-gebaseerde biomarkers met behulp van vloeibare biopsietechniek bloedmonsters verzameld van de kankerpatiënten, gevolgd door de scheiding van plasma en buffy coat. Vervolgens wordt plasma verwerkt voor de isolatie van cfDNA en wordt de respectieve buffy coat verwerkt voor de isolatie van het genomische DNA van een patiënt. Beide nucleïnezuurmonsters worden vervolgens gecontroleerd op hun hoeveelheid en kwaliteit; en geanalyseerd op mutaties met behulp van next-generation sequencing (NGS) technieken.

In dit manuscript presenteren we een gedetailleerd protocol voor vloeibare biopsie, inclusief bloedafname, plasma- en buffy coat separation, cfDNA en kiembaan-DNA-extractie, kwantificering van cfDNA of kiembaan-DNA en cfDNA-fragmentverrijkingsanalyse.

Introduction

Technologische vooruitgang heeft geleid tot de volgorde van honderden kankergenoom en transcriptomen¹. Dit heeft bijgedragen tot het begrijpen van landschappen van moleculaire veranderingen in verschillende kankertypen². Verdere studies naar deze landschappen hebben geholpen bij het karakteriseren van de sequentiële somatische veranderingen en gengenfusies³ die betrokken zijn bij kanker of tumorprogressie, door apoptoseroutes serieel te verstoren⁴. Daarom kunnen somatische mutaties en gengenfusies informatie over tumoren verstrekken door te dienen als biomarkers bij individuele patiënten voor een bepaald tumortype⁵, bestaande primaire tumorenprognose⁶te identificeren , secundaire tumoren te categoriseren op basis van moleculaire veranderingen⁷, en druggable tumordoelen te identificeren⁸. Dergelijke informatie kan vergemakkelijken bij het selecteren van gepersonaliseerde behandeling voor kankerpatiënten en bij het bepalen van positieve en negatieve behandelingsreacties⁹. Het verkrijgen van tumormateriaal voor het identificeren van genomische profilering van tumorweefsel is echter een invasieve procedure¹⁰. Bovendien omvat een tumorbiopsie slechts een klein deel van een heterogene tumor; en kan daarom niet representatief zijn voor het moleculaire profiel van de gehele tumor¹¹. Seriële monitoring en tumorgeneratie vereisen een herhaalde verzameling tumorweefsels, wat meestal niet haalbaar is vanwege de invasieve tumorbiopsieprocedure en de veiligheidsproblemen die voortvloeien uit dergelijke procedures¹².

De vloeibare biopsietechniek heeft daarentegen de afgelopen tien jaar enorme aandacht gekregen in precisie-oncologie^13,14. Het is voornamelijk te wijten aan de niet-invasieve van deze techniek en de mogelijkheid dat deze op meerdere tijdstipen wordt herhaald, waardoor een gebruiksvriendelijke en veilige monitoringtechniek voor de ziektecursussen^15,16mogelijk wordt. Vloeibare biopsie is gebaseerd op een fenomeen dat tumorcellen zich snel vermenigvuldigen, en tegelijkertijd ondergaan velen van hen apoptose en necrose. Dit leidt tot het vrijkomen van apoptotisch celafval in het bloed van de patiënten, samen met de DNA-fragmenten die op precieze grootte worden gesneden tijdens apoptose¹⁷. De apoptose van niet-kankercellen leidt ook tot het vrijkomen van zijn cellulaire puin in het bloed, maar de apoptosesnelheid in deze cellen is relatief veel lager dan tumorcellen¹⁸. De rationale van de vloeibare biopsietechniek is om tumor-geassocieerde moleculen zoals DNA, RNA, eiwitten en tumorcellen^14,19 vast te leggen die continu in het bloed circuleren. Verschillende technieken²⁰ kunnen worden gebruikt voor de analyse van deze moleculen, waaronder Next-Generation Sequencing (NGS), digitale druppelpolymerasekettingreactie (ddPCR), real-time PCR en enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA). Vloeibare biopsietechniek maakt het mogelijk om biomarkers te identificeren die kenmerken van tumorcellen zijn. Deze biomarkermoleculen komen niet alleen vrij uit specifieke delen van een tumor, maar eerder uit alle delen van de tumor²¹. Vandaar dat markers geïdentificeerd in vloeibare biopsie de moleculaire profilering van een volledige heterogene tumor vertegenwoordigen, naast andere tumoren in het lichaam, dus voordelen hebben ten opzichte van de op weefselbiopsie gebaseerde techniek²².

De cfDNA heeft een korte halfwaardetijd in het circulerende bloed, variërend van een paar minuten tot 1-2 uur²³. De korte halfwaardetijd van cfDNA vergemakkelijkt echter real-time analyses door de behandelingsrespons en dynamische tumorbeoordelingen te evalueren. De van tumoren afgeleide cfDNA-niveaus wijzen op prognose van het tumorstadium/-grootte, zoals blijkt uit verschillende studies, die een verband aantoonden tussen cfDNA-niveaus en de overlevingsresultaten²⁴. Bovendien hebben studies aangetoond dat de cfDNA een betere voorspellingscapaciteit heeft dan bestaande tumormarkers²⁵. De prognosticatie van cfDNA is nog sterker na kankerbehandeling, hogere niveaus van cfDNA na behandeling correleren goed met een verminderde overlevingskans en resistentie tegen behandeling. Terwijl lagere niveaus van cfDNA na de behandeling over het algemeen overeenkomen met een positieve behandelingsrespons. Bovendien vergemakkelijkt de cfDNA vroege detectie van de behandelingsrespons dan de traditionele detectiemethoden.

De cfDNA verhoogt de kans op vroegtijdige opsporing van kankergerelateerde mutaties: tijdens ziekte in een vroeg stadium¹⁵, het begin van symptomen²⁶ en vóór kankerdiagnose tot 2 jaar²⁷. Aangezien cfDNA wordt vrijgegeven uit meerdere tumorgebieden of foci, biedt de analyse een uitgebreid overzicht van het tumorgenoom dat het^{vertegenwoordigt 28}. Daarom maakt de cfDNA het mogelijk somatische mutaties te detecteren die mogelijk zijn gemist in de weefselmonsters²⁹. Aangezien intra-tumor heterogeniteit en subklonale mutaties kunnen worden gedetecteerd door diepe sequencing van genomische regio’s die duizenden bases beslaan, maakt de analyse van de cfDNA het mogelijk om specifieke moleculaire subtypen met afzonderlijke genomische handtekeningen te ontdekken¹³. Om een vergelijkbaar niveau van informatie via weefselmonster te verkrijgen, zouden veel vaste biopsieën nodig zijn geweest.

Bovendien bleek het cfDNA-gehalte bij patiënten met een gelokaliseerde ziekte zoals dikke darm-, eierstok- en longkanker na een chirurgische behandeling en/of chemotherapie een krachtige prognostische marker te zijn voor terugkeer van kanker en behandelingsresultaten²⁰. Bovendien konden bij patiënten met darm-, borst- en longkanker analyses van cfDNA uit het bloed met succes de tumorspecifieke veranderingen detecteren, wat leidde tot de nauwkeurige voorspelling van recidief enkele maanden van tevoren¹³. Bovendien zijn de behandelingsresistentiemarkers, zoals KRAS-mutaties bij patiënten met CRC die anti-EGFR-therapie krijgen³⁰; VAF’s voor genen zoals PIK3CA, MED1 of EGFR bij patiënten met borstkanker na de behandeling met verschillende therapieën³¹; en EGFR T790M resistentiemutatie bij longkankerpatiënten behandeld met EGFR-gerichte TKIs³² kan ook worden geïdentificeerd door cfDNA-analyse.

Samengevat kan de cfDNA-analyse worden gebruikt om nauwkeurige biomarkers op het gebied van oncologie^13,33te identificeren . In dit protocol werden bloedmonsters van 3 glioompatiënten en 3 gezonde controles verwerkt om genomisch DNA van WBC’s en cfDNA uit het plasma te verkrijgen. Bij glioomkanker dienen mutaties in IDH , TERT, ATRX, EGFR pt TP53 als diagnostische en prognostische markers die kunnen helpen bij de vroege diagnose van glioomtumoren, het classificeren van verschillende soorten glioomtumoren, het begeleiden van de nauwkeurige behandeling voor de individuele patiënt en het begrijpen van de behandelingsrespons^34,35. Mutatiestatus van deze genen kan worden geïdentificeerd met behulp van bloed-afgeleide cfDNA. In dit manuscript presenteren we een gedetailleerd protocol van plasma-afgeleid cfDNA dat is gebruikt voor het bestuderen van mutatieveranderingen in glioomkanker¹². Een dergelijk op cfDNA gebaseerd vloeibaar biopsieprotocol dat in dit artikel wordt uitgelegd, kan worden gebruikt voor het bestuderen van mutatieveranderingen bij veel andere soorten kankers. Bovendien heeft een recente studie aangetoond dat op cfDNA gebaseerde vloeibare biopsie 50 verschillende soorten kankers kan detecteren³⁶.

Het verzamelen, opslaan en verzenden van bloedmonsters zijn cruciale stappen in dit protocol, omdat ongecontroleerde temperatuur tijdens deze stappen lyse van WBC’s veroorzaakt, wat leidt tot het vrijkomen van genomisch DNA uit de WBC in het plasma en verontreiniging van het cfDNA-monster veroorzaakt, wat de rest van de procedure beïnvloedt³⁷. Hemolyse als gevolg van ongecontroleerde temperatuur kan downstream monstervoorbereidingsprocessen van cfDNA aantasten, zoals de PCR-stappen³⁸. Het serum bevat een hoog percentage kiembaan cfDNA in plaats van plasma, hoewel het een groot achtergrondgeluid vertoont voor tumor-geassocieerde cfDNA³⁹. Daarom is plasma voor het isoleren van tumorgerelateerde cfDNA een geschikt monster³⁹. Bloed dat wordt getrokken in een anticoagulant dat bloedafnamebuis bevat, moet onmiddellijk of binnen maximaal twee uur worden gecentrifugeerd, om het plasma te scheiden en cfDNA-besmetting te voorkomen. In dit protocol worden speciale commerciële cfDNA-conserveringsbloedafnamebuizen gebruikt (zie Tabel met materialen),die een alternatief zijn voor anticoagulantiva die bloedafnamebuizen bevatten. Deze speciale bloedafnamebuizen behouden cfDNA en cfRNA en voorkomen lyse van WBC’s gedurende maximaal 30 dagen bij omgevingstemperatuur en tot 8 dagen bij 37 °C. Dit vergemakkelijkt het handhaven van de juiste temperatuur tijdens een bloedmonsterverzending en totdat het plasma en WBC zijn gescheiden⁴⁰.

Er zijn momenteel drie soorten cfDNA-extractiemethodologieën beschikbaar: fase-isolatie, spinkolom op basis van siliciummembraan en isolatie op basis van magnetische kralen⁴¹. De op siliciummembraan gebaseerde spinkolommethode leverde een hoge hoeveelheid cfDNA op met een hoge integriteit in vergelijking met andere cfDNA-extractiemethoden⁴².

De kwantitatieve evaluatie van DNA is een fundamentele vereiste in vloeibare biopsie, er is behoefte aan het ontwikkelen van een eenvoudige, betaalbare en gestandaardiseerde procedure voor hun eenvoudige implementatie en breed gebruik. Drie veelgebruikte methoden voor cfDNA-kwantificering zijn spectrofotometrisch, fluorimetrisch en qPCR. De fluorimetrische methode is beter bewezen ten opzichte van de andere methoden met betrekking tot de nauwkeurigheid, kosten en het gemak van geleiding⁴³.

De integriteit en zuiverheid van de cfDNA kan worden geschat door agarose-elektroforese of capillaire elektroforese. Agarose elektroforese toont noch gevoeligheid bij lage concentratie cfDNA noch heeft hoge resolutie om nauwkeurige fragmentgrootte van cfDNA te tonen. Aan de andere kant heeft capillaire elektroforese een voordeel ten opzichte van de agarose-elektroforese door de bijbehorende uitdagingen te overwinnen en daarom veel gebruikt door de onderzoekers voor cfDNA-fragmentgrootteanalyse. In dit protocol werd de fragmentgrootteverdeling van geïsoleerde cfDNA geschat met behulp van een geautomatiseerd capillair elektroforese-instrument (zie Tabel met materialen).

Protocol

Voorafgaand aan de bloedafname is geïnformeerde toestemming vereist van proefpersonen die deelnemen aan het onderzoek en moeten deze worden verkregen. Het in dit manuscript beschreven onderzoek werd uitgevoerd in overeenstemming met en naleving van het Rabin Medical Center, Israël ethic committee (ethische code: 0039-17-RMC) en de Faculteit Geneeskunde Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Duitsland ethic committee (ethische code: D 405/14). 1. Bloedmonsterverzameling en -opslag in cfD…

Representative Results

Plasmascheiding8,5-9 ml bloed verzameld in cfDNA of cfRNA conserveermiddel buizen levert ongeveer ~4 ml plasma in volume. Het volume plasma gescheiden van bloed verzameld in EDTA-buizen kan variëren afhankelijk van de temperatuur. Blootstelling van EDTA-buizen die bloed bevatten bij een temperatuur hoger dan 37 °C leidt tot een verminderde plasmavolumeopbrengst44. Fluorometer Assay ResultatencfDNA-concentratie in 1 ml plasma v…

Discussion

Het verzamelen van bloed van een patiënt in een buis, verzending en opslag zijn cruciale eerste stappen in vloeibare biopsie. Onjuiste behandeling kan de kwaliteit van het plasma aantasten en kan daarom de resultaten van de vloeibare biopsie^{verstoren 47}. Als een bloedmonster wordt verzameld in een EDTA-bloedbuis, moet het plasma binnen twee uur na de bloedafname worden gescheiden om lyse van WBC’s te voorkomen en het genomische DNA in het plasma vrij te geven⁴⁸. WBC’s kunn…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C