Nachweis zellfreier DNA in Blutplasmaproben von Krebspatienten

Summary

In diesem Beitrag stellen wir ein detailliertes Protokoll für die nichtinvasive flüssige Biopsietechnik vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Abstract

Die Identifizierung von Mutationen in Tumoren von Krebspatienten ist ein sehr wichtiger Schritt im Krankheitsmanagement. Diese Mutationen dienen als Biomarker für die Tumordiagnose sowie für die Behandlungsauswahl und deren Reaktion bei Krebspatienten. Die aktuelle Goldstandardmethode zum Nachweis von Tumormutationen beinhaltet einen genetischen Test der Tumor-DNA mittels Tumorbiopsien. Diese invasive Methode ist jedoch nur schwer wiederholt als Folgetest des Tumormutationsrepertoires durchzuführen. Flüssigbiopsie ist eine neue und aufkommende Technik, um Tumormutationen als einfach zu bedienenden und nicht-invasiven Biopsieansatz zu erkennen.

Krebszellen vermehren sich schnell. Parallel dazu erkranken zahlreiche Krebszellen einer Apoptose. Trümmer dieser Zellen werden in das Kreislaufsystem eines Patienten freigesetzt, zusammen mit fein fragmentierten DNA-Stücken, sogenannten zellfreien DNA-Fragmenten (cfDNA), die Tumor-DNA-Mutationen tragen. Daher werden zur Identifizierung von cfDNA-basierten Biomarkern mit flüssiger Biopsietechnik Blutproben von den Krebspatienten entnommen, gefolgt von der Trennung von Plasma und buffy Coat. Als nächstes wird Plasma zur Isolierung von cfDNA und das jeweilige Buffy-Mantel zur Isolierung der genomischen DNA eines Patienten verarbeitet. Beide Nukleinsäureproben werden dann auf ihre Menge und Qualität überprüft; und auf Mutationen mit NGS-Techniken der nächsten Generation analysiert.

In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll für die flüssige Biopsie vor, einschließlich Blutentnahme, Plasma- und Buffy-Coat-Trennung, cfDNA- und Keimbahn-DNA-Extraktion, Quantifizierung von cfDNA- oder Keimbahn-DNA und cfDNA-Fragmentanreicherungsanalyse.

Introduction

Technologische Fortschritte haben zur Sequenzierung von Hunderten von Krebsgenomen und Transkriptomen¹geführt. Dies hat dazu beigetragen, Landschaften molekularer Veränderungen über verschiedene Krebsarten hinweg zu verstehen². Weitere Studien zu diesen Landschaften haben dazu beigetragen, die sequenziellen somatischen Veränderungen und Gen-Gen-Fusionen³ zu charakterisieren, die an Krebs oder Tumorprogression beteiligt sind, indem sie die Apoptosewege seriell stören⁴. Daher können somatische Mutationen und Gen-Gen-Fusionen Informationen über Tumore liefern, indem sie als Biomarker bei einzelnen Patienten für einen bestimmten Tumortyp⁵dienen, bestehende Primärtumoren-Prognose⁶identifizieren, sekundäre Tumoren auf der Grundlage molekularer Veränderungen kategorisieren⁷, und medikamentöse Tumorziele^{identifizieren 8}. Solche Informationen können bei der Auswahl einer personalisierten Behandlung für Krebspatienten und bei der Bestimmung positiver und negativer Behandlungsreaktionen^{erleichtern 9}. Die Gewinnung von Tumormaterial zur Identifizierung der genomischen Profilierung von Tumorgewebe ist jedoch ein invasives Verfahren¹⁰. Darüber hinaus umfasst eine Tumorbiopsie nur einen kleinen Teil eines heterogenen Tumors; und darf daher nicht repräsentativ für das molekulare Profil des gesamten Tumors¹¹sein. Serielle Überwachung und Tumor-Genotypisierung erfordern eine wiederholte Sammlung von Tumorgeweben, was in der Regel aufgrund der Invasivität des Tumorbiopsieverfahrens und der Sicherheitsprobleme, die sich aus solchen Verfahren ergeben, nicht machbar ist¹².

Die flüssige Biopsie-Technik hingegen hat in den letzten zehn Jahren enorme Aufmerksamkeit in der Präzisions-Onkologie erlangt^13,14. Es ist vor allem aufgrund der Nicht-Invasivität dieser Technik, und die Möglichkeit, dass es an mehreren Zeitpunkten wiederholt werden, wodurch eine einfach zu bedienende und sichere Überwachungstechnik für die Krankheitskurse^15,16ermöglicht wird. Die Flüssigbiopsie basiert auf einem Phänomen, dass sich Tumorzellen schnell vermehren und gleichzeitig viele von ihnen apoptosis und nekrose leiden. Dies führt zur Freisetzung von apoptotischen Zellablagerungen in das Blut der Patienten, zusammen mit den DNA-Fragmenten, die bei Apoptose¹⁷in präzisen Größen geschnitten werden. Die Apoptose von nicht-kanzerösen Zellen führt auch zur Freisetzung ihrer zellulären Ablagerungen in das Blut, jedoch ist die Apoptoserate in diesen Zellen relativ viel niedriger als die tumorzellen¹⁸. Der Grund der flüssigen Biopsietechnik besteht darin, tumorassoziierte Moleküle wie DNA, RNA, Proteine und Tumorzellen^14,19 zu erfassen, die kontinuierlich im Blut zirkulieren. Für die Analyse dieser Moleküle können verschiedene Techniken²⁰ verwendet werden, darunter Next-Generation Sequencing (NGS), digitale Tröpfchenpolymerase-Kettenreaktion (ddPCR), Echtzeit-PCR und enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA). Die Flüssigbiopsietechnik ermöglicht die Identifizierung von Biomarkern, die Merkmale von Tumorzellen sind. Diese Biomarkermoleküle werden nicht nur aus bestimmten Teilen eines Tumors freigesetzt, sondern aus allen Teilen des Tumors²¹. Daher stellen marker, die in der flüssigen Biopsie identifiziert werden, die molekulare Profilierung eines gesamten heterogenen Tumors dar, zusätzlich zu anderen Tumoren im Körper, also Vorteile gegenüber der Gewebebiopsie-basierten Technik²².

Die cfDNA hat eine kurze Halbwertszeit im zirkulierenden Blut von wenigen Minuten bis 1-2 Stunden²³. Die kurze Halbwertszeit von cfDNA ermöglicht jedoch Echtzeitanalysen durch die Bewertung der Behandlungsreaktionen und dynamischen Tumorbewertungen. Die tumorabgeleiteten cfDNA-Spiegel zeigen eine Prognose des Tumorstadiums/der Tumorgröße, die durch mehrere Studien belegt wurde, die einen Zusammenhang zwischen cfDNA-Spiegeln und den Überlebensergebnissen²⁴zeigten. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die cfDNA eine bessere Vorhersagekapazität als bestehende Tumormarker^{hat 25}. Die Prognose von cfDNA ist nach der Krebsbehandlung noch ausgeprägter, höhere cfDNA-Konzentrationen nach der Behandlung korrelieren gut mit einer reduzierten Überlebensrate und Resistenz gegen die Behandlung. Während niedrigere cfDNA-Werte nach der Therapie im Allgemeinen mit einem positiven Behandlungsverhalten korrespondiert. Darüber hinaus erleichtert die cfDNA die Früherkennung des Behandlungsreaktionens als die herkömmlichen Nachweismethoden.

Die cfDNA erhöht die Möglichkeit der Früherkennung von krebsassoziierten Mutationen: während der Frühstadium-Krankheit¹⁵, das Auftreten der Symptome²⁶ und vor der Krebsdiagnose bis zu 2 Jahre²⁷. Da cfDNA aus mehreren Tumorregionen oder Brennpunkten freigesetzt wird, bietet seine Analyse einen umfassenden Überblick über das Tumorgenom, das²⁸darstellt. Daher ermöglicht die cfDNA, somatische Mutationen zu erkennen, die in den Gewebeproben übersehen worden sein könnten²⁹. Da intratumorliche Heterogenität und subklonale Mutationen durch tiefe Sequenzierung genomischer Regionen, die sich über Tausende von Basen erstrecken, nachgewiesen werden können, ermöglicht die Analyse der cfDNA die Aufdeckung spezifischer molekularer Subtypen mit deutlichen genomischen Signaturen¹³. Um ein ähnliches Maß an Informationen durch Gewebeproben zu erhalten, wären viele feste Biopsien erforderlich gewesen.

Darüber hinaus erwiesen sich die cfDNA-Spiegel bei Patienten mit einer lokalisierten Erkrankung wie Dickdarm-, Eierstock- und Lungenkrebs nach einer chirurgischen Behandlung und/oder Chemotherapie als ein starker prognostischer Marker für das Wiederauftreten von Krebs und die Behandlungsergebnisse²⁰. Darüber hinaus konnten bei Patienten mit Dickdarm-, Brust- und Lungenkrebs Analysen der cfDNA aus dem Blut die tumorspezifischen Veränderungen erfolgreich erkennen, was zur genauen Vorhersage eines Rezidivs mehrere Monate im Voraus¹³führte. Darüber hinaus sind die Behandlungsresistenzmarker, wie KRAS-Mutationen bei Patienten mit CRC, die eine Anti-EGFR-Therapie^{erhalten, 30}; VAFs für Gene wie PIK3CA, MED1 oder EGFR bei Patientinnen mit Brustkrebs nach der Behandlung mit verschiedenen Therapien³¹; und EGFR T790M Resistenzmutation bei Lungenkrebspatienten, die mit EGFR-gezielten TKIs³² behandelt wurden, können auch durch cfDNA-Analyse identifiziert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die cfDNA-Analyse verwendet werden kann, um präzise Biomarker im Bereich der Onkologie^13,33zu identifizieren. In diesem Protokoll wurden Blutproben von 3 Gliom-Patienten und 3 gesunde Kontrollen verarbeitet, um genomische DNA aus WBCs und cfDNA aus dem Plasma zu erhalten. Bei Gliomkrebs dienen Mutationen bei IDH, TERT, ATRX, EGFR und TP53 als diagnostische sowie prognostische Marker, die bei der Frühdiagnose von Gliomtumoren helfen können, verschiedene Arten von Gliomtumoren zu klassifizieren, die genaue Behandlung für den einzelnen Patienten zu leiten und das Behandlungsverhalten zu verstehen^34,35. Der Mutationsstatus dieser Gene kann mit blutabgeleiteter cfDNA identifiziert werden. In diesem Manuskript stellen wir ein detailliertes Protokoll der plasmaabgeleiteten cfDNA vor, das zur Untersuchung von Mutationsveränderungen bei Gliomkrebs verwendet wurde¹². Ein solches cfDNA-basiertes Flüssigbiopsieprotokoll, das in diesem Artikel erläutert wird, kann zur Untersuchung von Mutationsveränderungen bei vielen anderen Krebsarten verwendet werden. Darüber hinaus hat eine aktuelle Studie gezeigt, dass cfDNA-basierte Flüssigbiopsie 50 verschiedene Krebsarten erkennen kann³⁶.

Die Entnahme, Lagerung und Verbringung von Blutproben sind entscheidende Schritte in diesem Protokoll, da die unkontrollierte Temperatur während dieser Schritte eine Lyse von WBCs verursacht, die zur Freisetzung genomischer DNA aus dem WBC in das Plasma führt und eine Kontamination der cfDNA-Probe verursacht, die den Rest des Verfahrens betrifft³⁷. Hämolyse aufgrund unkontrollierter Temperatur kann nachgeschaltete Probenvorbereitungsprozesse von cfDNA beeinträchtigen, wie z. B. die PCR-Schritte³⁸. Das Serum enthält einen hohen Anteil an Keimbahn cfDNA anstelle von Plasma, obwohl es ein großes Hintergrundrauschen für tumorassoziierte cfDNA³⁹darstellt. Daher ist Plasma zur Isolierung tumorassoziierter cfDNA eine geeignete Probe³⁹. Blut, das in einem mit Blutentnahmeröhrchen haltigen Antikoagulans entnommen wird, sollte sofort oder innerhalb von bis zu zwei Stunden zentrifugiert werden, um das Plasma zu trennen und eine cfDNA-Kontamination zu vermeiden. In diesem Protokoll werden spezielle kommerzielle cfDNA-Konservierungsblutentnahmeröhrchen verwendet (siehe Tabelle der Materialien), die eine Alternative zu gerinnungshemmenden Blutentnahmeröhrchen darstellen. Diese speziellen Blutentnahmeröhrchen bewahren cfDNA und cfRNA und verhindern eine Lyse von WBCs für bis zu 30 Tage bei Umgebungstemperatur und bis zu 8 Tage bei 37 °C. Dies erleichtert die Aufrechterhaltung der entsprechenden Temperatur während einer Blutprobensendung und bis plasma- und WBC-Trennung⁴⁰.

Derzeit gibt es drei Arten von cfDNA-Extraktionsmethoden: Phasenisolierung, Siliziummembran-basierte Spin-Säule und magnetische Perlen-basierte Isolierung⁴¹. Das Siliziummembran-basierte Spinsäulenverfahren lieferte eine hohe Menge an cfDNA mit hoher Integrität im Vergleich zu anderen cfDNA-Extraktionsmethoden⁴².

Die quantitative Auswertung von DNA ist eine grundlegende Anforderung in der flüssigen Biopsie, es besteht die Notwendigkeit, ein einfaches, erschwingliches und standardisiertes Verfahren für ihre einfache Umsetzung und breite Nutzung zu entwickeln. Drei häufig verwendete Methoden zur cfDNA-Quantifizierung sind spektrophotometrische, fluorimetrische und qPCR. Die fluorimetrische Methode ist besser als die anderen Methoden in Bezug auf die Genauigkeit, Kosten und Leichtigkeit der Leitung⁴³.

Die Integrität und Reinheit der cfDNA kann entweder durch Agaroseelektrophorese oder Kapillarelektrophorese geschätzt werden. Die Agarose-Elektrophorese zeigt weder eine Empfindlichkeit bei geringer CfDNA-Konzentration noch hat sie eine hohe Auflösung, um eine genaue Fragmentgröße von cfDNA zu zeigen. Andererseits hat die Kapillarelektrophorese einen Vorteil gegenüber der Agaroseelektrophorese, indem sie die damit verbundenen Herausforderungen überwindet und daher von den Forschern für die cfDNA-Fragmentgrößenanalyse weit verbreitet ist. In diesem Protokoll wurde die Fragmentgrößenverteilung isolierter cfDNA mit einem automatisierten Kapillarelektrophorese-Instrument geschätzt (siehe Tabelle der Materialien).

Protocol

Vor der Blutentnahme ist die informierte Zustimmung der an der Forschung beteiligten Personen erforderlich und muss eingeholt werden. Die in diesem Manuskript beschriebene Forschung wurde in Übereinstimmung mit dem Rabin Medical Center, dem israelischen Ethikkomitee (Ethikkodex: 0039-17-RMC) und der Medizinischen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Deutschland, durchgeführt (Ethikkodex: D 405/14). 1. Blutprobenentnahme und -speicherung in cfDNA- oder cfRNA-Konservierungsrö…

Representative Results

Plasma-Trennung8,5-9 ml Blut, das in cfDNA- oder cfRNA-Konservierungsröhrchen gesammelt wird, ergibt ein Volumen von ca. 4 ml Plasma. Das Volumen des Plasmas, das von blutgebundenen Blutinues in EDTA-Röhren getrennt ist, kann je nach Temperatur variieren. Die Exposition von EDTA-Röhren, die Blut bei einer Temperatur von mehr als 37 °C enthalten, führt zu einer verringerten Plasmavolumenausbeute44. Fluorometer-Assay-Ergebnisse<b…

Discussion

Die Entnahme des Blutes eines Patienten in einer Röhre, der Versand und die Lagerung sind entscheidende erste Schritte in der flüssigen Biopsie. Unsachgemäße Handhabung kann die Qualität des Plasmas beeinträchtigen und daher die Ergebnisse der flüssigen Biopsie^{stören 47}. Wenn eine Blutprobe in einem EDTA-Blutröhrchen entnommen wird, muss das Plasma innerhalb von zwei Stunden nach der Blutentnahme getrennt werden, um eine Lyse von WBCs und die Freisetzung seiner genomischen DNA in das Plas…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C