がん患者の血漿サンプルにおける無細胞DNAの検出

Summary

本論文では、非侵襲的な液体生検法の詳細なプロトコルを紹介し、血液採取、血漿およびバフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量、cfDNA断片濃縮分析を含む。

Abstract

がん患者の腫瘍の変異を特定することは、疾患管理において非常に重要なステップです。これらの突然変異は、腫瘍診断のためのバイオマーカーとしてだけでなく、癌患者における治療選択および応答のために役立つ。腫瘍の突然変異を検出するための現在の金標準法は、腫瘍生検による腫瘍DNAの遺伝子検査を伴う。しかし、この侵襲的な方法は、腫瘍突然変異レパートリーのフォローアップ試験として繰り返し行うことは困難である。液体生検は、使いやすく非侵襲的な生検アプローチとして腫瘍突然変異を検出するための新しい新しい技術です。

がん細胞は急速に増殖します。並行して、多数の癌細胞がアポトーシスを受ける。これらの細胞の破片は、腫瘍DNA突然変異を運ぶ無細胞DNA(cfDNA)断片と呼ばれる細かく断片化されたDNA片と共に、患者の循環系に放出される。そこで、液体生検法を用いてcfDNAベースのバイオマーカーを同定するため、血液サンプルを癌患者から採取し、続いて血漿およびバフィーコートを分離する。次に、血漿はcfDNAの単離のために処理され、それぞれのバフィーコートは患者のゲノムDNAの単離のために処理される。その後、両方の核酸サンプルの量と品質がチェックされます。次世代シーケンシング(NGS)技術を用いて変異を解析する。

本稿では、血液採取、血漿、バフィーコート分離、cfDNAおよび生殖系列DNA抽出、cfDNAまたは生殖系列DNAの定量化、cfDNA断片濃縮分析を含む液体生検の詳細なプロトコルを紹介する。

Introduction

技術の進歩は、何百もの癌ゲノムとトランスクリプトム1のシーケンシング^{につながっています。}これは、異なる癌タイプ間の分子変化の風景を理解するのに貢献^{しています 2}.これらの景観に関するさらなる研究は、癌または腫瘍の進行に関与する逐次体細胞変化および遺伝子遺伝子融合³ を特徴付け、アポトーシス経路⁴を連続的に破壊することによって助けた。したがって、体細胞変異および遺伝子融合は、特定の腫瘍タイプ⁵の個々の患者においてバイオマーカーとして機能し、既存の原発性腫瘍予後⁶を同定し、分子変化^に基づいて二次腫瘍を分類し、薬物性腫瘍標的^を同定することにより、腫瘍に関する情報を提供することができる。このような情報は、がん患者に対する個別の治療を選択し、陽性および陰性の治療応答を決定する際に容易にすることができる^9.しかし、腫瘍組織のゲノムプロファイリングを同定するための腫瘍物質を得ることは、侵襲的な手順¹⁰である。さらに、腫瘍生検は異種腫瘍のごく一部のみを含む。したがって、腫瘍¹¹全体の分子プロファイルを代表するものではなくてもよい。連続モニタリングおよび腫瘍ジェノタイピングは、腫瘍組織の繰り返し収集を必要とするが、これは、通常、腫瘍生検処置の侵襲性およびそのような手順¹²から生じる安全性の問題のために実現不可能である。

一方、液体生検技術は、過去10年間で精密腫瘍学で大きな注目を集めています^13,14.これは主にこの技術の非侵襲性によるものであり、複数の時点で繰り返される可能性があるため、疾患コース^15,16に対する使いやすく安全なモニタリング技術が可能となる。液体生検は、腫瘍細胞が急速に増殖し、同時に多くの細胞がアポトーシスと壊死を起こる現象に基づいています。これは、アポトーシス¹⁷の間に正確なサイズで切断されるDNA断片と共に、患者の血液中にアポトーシス細胞の破片の放出をもたらす。非癌性細胞のアポトーシスは、その細胞の破片の血液への放出にもつながり、しかし、これらの細胞におけるアポトーシス率は腫瘍細胞¹⁸より比較的低い。液体生検技術の合理的な方法は、血液中を連続的に循環するDNA、RNA、タンパク質、および腫瘍細胞^14、19などの腫瘍関連分子を捕捉することである。次世代シーケンシング(NGS)、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(ddPCR)、リアルタイムPCR、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)など、これらの分子の分析に種々の技術²⁰を用いることができる。液体バイオプシー技術により、腫瘍細胞の特徴であるバイオマーカーを同定することができます。これらのバイオマーカー分子は、腫瘍の特定の部分から放出されるだけでなく、腫瘍²¹のすべての部分から放出される。したがって、液体生検で同定されたマーカーは、異種腫瘍全体の分子プロファイリングを表し、体内の他の腫瘍に加えて、組織生検ベースの技術²²よりも優れたものを有する。

cfDNAは、数分から1〜2時間²³に及ぶ循環血液中の短い半減期時間を有する。しかし、cfDNAの短い半減期は、治療応答と動的腫瘍評価を評価することによってリアルタイム分析を容易にする。腫瘍由来cfDNAレベルは、いくつかの研究によって証明された腫瘍段階/サイズの予後を示し、cfDNAレベルと生存結果²⁴との関係を示した。さらに、cfDNAが既存の腫瘍マーカー²⁵よりも優れた予測能力を有することが研究で証明されている。cfDNAの予後は癌治療後にさらに顕著であり、cfDNAの治療後の高いレベルは生存率の低下と良好に相関し、治療に対する耐性を有する。一方、cfDNA療法の低レベルは、一般的に陽性治療応答に対応する。さらに、cfDNAは従来の検出方法よりも治療応答の早期検出を促進する。

cfDNAは、癌関連突然変異の早期発見の可能性を高める:早期疾患¹⁵の間に、症状²⁶ の発症および癌診断前2年²⁷年まで。cfDNAは複数の腫瘍領域または病巣から放出されるので、その分析は、それが²⁸を表す腫瘍ゲノムの包括的なビューを提供する。したがって、cfDNAは、組織サンプル²⁹で見逃された可能性のある体細胞突然変異を検出することを可能にする。腫瘍内不均一性およびクローン下突然変異は、数千の塩基に及ぶゲノム領域の深いシーケンシングによって検出することができるので、cfDNAの分析は、明確なゲノムシグネチャ¹³を有する特定の分子サブタイプを発見することを可能にする。組織サンプルを通じて同様のレベルの情報を得るためには、多くの固体生検が必要であったであろう。

さらに、手術後の結腸、卵巣、肺癌などの局在性疾患を有する患者におけるcfDNAレベルおよび/または化学療法は、癌再発および治療結果²⁰に対する強力な予後マーカーであることが実証された。さらに、結腸、乳癌、肺癌の患者では、血液からのcfDNAの分析は腫瘍特異的な変化を正常に検出することができ、これは数ヶ月前に再発の正確な予測につながった^13。さらに、抗EGFR療法³⁰を受けたCRC患者におけるKRAS突然変異などの治療抵抗マーカー様々な治療法による治療後の乳癌患者におけるPIK3CA、MED1またはEGFRなどの遺伝子のVAF^31; EGFR標的^TKU32で治療された肺癌患者におけるEGFR T790M耐性変異とEGFR T790M耐性変異もcfDNA分析によって同定することができる。

要約すると、cfDNA分析は、腫瘍学^13、33の分野における正確なバイオマーカーを同定するために使用することができる。このプロトコルでは、3人のグリオーマ患者と3人の健康なコントロールの血液サンプルを処理し、血漿からWbCsおよびcfDNAからゲノムDNAを得た。グリオーマ癌において、IDH、TERT、ATRX、EGFR、およびTP53の突然変異は、グリオーマ腫瘍の早期診断に役立つ診断および予後マーカーとして機能し、異なるタイプのグリオーマ腫瘍を分類し、個々の患者に対する正確な治療を導き、治療応答^34、35を理解する。 これらの遺伝子の変異状態は、血液由来cfDNAを用いて同定することができる。本稿では、神経膠腫癌¹²の変異変化を研究するために用いられてきた血漿由来cfDNAの詳細なプロトコルを提示する。この記事で説明されているこのようなcfDNAベースの液体生検プロトコルは、他の多くのタイプの癌の突然変異変化を研究するために使用することができる。さらに、最近の研究では、cfDNAベースの液体生検が50種類の癌³⁶を検出できることを示している。

血液サンプル採取、保存、および出荷は、これらのステップ中の制御されていない温度がWBCのリシスを引き起こし、WBCから血漿中にゲノムDNAが放出され、cfDNAサンプルの汚染を引き起こし、手順³⁷の残りの部分に影響を与えるため、このプロトコルにおいて重要なステップである。制御されていない温度による浸透圧は、PCRステップ³⁸のようなcfDNAの下流サンプル調製プロセスを損なう可能性がある。血清は血漿ではなく生殖細胞系cfDNAの割合が高いが、腫瘍関連^cfDNA39には大きなバックグラウンドノイズを示す。従って、腫瘍関連cfDNAを単離するためには、血漿は、適当な試料³⁹である。採血管を含む抗凝固剤に採取された血液は、血漿を分離し、cfDNA汚染を避けるために、直ちにまたは最大2時間以内に遠心分離する必要があります。このプロトコルでは、専用の市販のcfDNA保存血液採取管(材料表を参照)が使用されており、これは採血管を含む抗凝固剤の代替である。これらの専用の採血管はcfDNAおよびcfRNAを維持し、周囲温度で30日まで、そして37°Cで8日間まで、Wbcのリシスを防ぐ。 これは、血液サンプルの出荷中および血漿とWBCが分離されるまで適切な温度を維持することを容易にする^40.

現在利用可能なcfDNA抽出方法論には、位相分離、シリコン膜ベースのスピンカラム、磁気ビーズベースの絶縁⁴¹の3種類があります。シリコン膜ベースのスピンカラム法は、他のcfDNA抽出方法⁴²と比較して、高い完全性を有する高い量のcfDNAを生み出した。

DNAの定量的評価は液体生検における基本的な要件であり、その容易な実施および広い使用のための簡単で、現実的で、標準化された手順を開発する必要性がある。cfDNA定量に一般的に使用される3つの方法は、分光光度測定、蛍光測定法、およびqPCRです。この蛍光測定法は、精度、コスト、および伝導の容易さ⁴³に関する他の方法よりも優れている。

cfDNAの完全性および純度はアガロース電気泳動か毛細管電気泳動によって推定することができる。アガロース電気泳動は、cfDNAの低濃度で感度を示すことも、cfDNAの正確なフラグメントサイズを示す高分解能も示していません。一方、毛細管電気泳動は、関連する課題を克服することでアガロース電気泳動よりも優位性があり、したがってcfDNAフラグメントサイズ分析のために研究者によって広く使用されています。このプロトコルでは、分離されたcfDNAのフラグメントサイズ分布を、自動キャピラリー電気泳動器を用いて推定した( 材料表を参照)。

Protocol

採血前に、研究に参加する被験者からのインフォームド・コンセントが必要であり、取得する必要があります。この原稿に記載されている研究は、ラビン医療センター、イスラエル倫理委員会(倫理規範:0039-17-RMC)、医学部Derクリスチャン・アルブレヒト・ズ・キール、ドイツ倫理委員会(倫理コード:D 405/14)に従って行われました。 1. cfDNAまたはcfRNA保存チューブ内の血液サ?…

Representative Results

プラズマ分離cfDNAまたはcfRNA保存チューブで採取された8.5〜9 mLの血液は、体積の約〜4 mLの血漿を得る。EDTAチューブに採取された血液から分離された血漿の体積は、温度によって異なる場合があります。37°Cより高い温度で血液を含むEDTAチューブの暴露は、血漿体積収率44の低下をもたらす。 フルオロメーターアッセイ結果<br…

Discussion

チューブ内の患者の血液の収集、出荷および貯蔵は液体生検の重要な初期ステップである。不適切な取り扱いは、プラズマの品質を損なう可能性があり、したがって、液体生検⁴⁷の結果を妨げる可能性がある。血液サンプルがEDTA血液管に採取された場合、血漿は、BPCのリシスおよび血漿⁴⁸へのそのゲノムDNAの放出を避けるために、採血の2時間以内に分離さ?…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C