Обнаружение ДНК без клеток в образцах плазмы крови онкологических больных

Summary

В этой статье мы представляем подробный протокол для неинвазивной жидкостной биопсии техники, в том числе сбора крови, плазмы и баффи пальто разделения, cfDNA и зародышевой ДНК извлечения, количественной оценки cfDNA или зародышевой ДНК, и cfDNA анализ обогащения фрагментов.

Abstract

Выявление мутаций в опухолях онкологических больных является очень важным шагом в лечении заболеваний. Эти мутации служат биомаркерами для диагностики опухоли, а также для отбора лечения и его реакции у онкологических больных. Нынешний метод золотого стандарта для обнаружения мутаций опухоли включает в себя генетический тест ДНК опухоли с помощью биопсии опухоли. Тем не менее, этот инвазивный метод трудно выполнить повторно в качестве последующего теста опухолевых мутационных репертуара. Биопсия жидкости является новым и новым методом для обнаружения мутаций опухоли в качестве простого в использовании и неинвазивного подхода к биопсии.

Раковые клетки быстро размножаются. Параллельно многочисленные раковые клетки подвергаются апоптозу. Мусор из этих клеток высвобождается в кровеносную систему пациента, вместе с мелко фрагментированными фрагментами ДНК, называемыми фрагментами ДНК без клеток (cfDNA), которые несут мутации ДНК опухоли. Поэтому для выявления биомаркеров на основе cfDNA с использованием метода жидкой биопсии, образцы крови собираются у онкологических больных, а затем разделение плазмы и баффи пальто. Далее плазма обрабатывается для изоляции cfDNA, и соответствующие баффи пальто обрабатывается для изоляции геномной ДНК пациента. Оба образца нуклеиновой кислоты затем проверяются на их количество и качество; и проанализированы на мутации с использованием методов секвенирования нового поколения (NGS).

В этой рукописи мы представляем подробный протокол для жидкой биопсии, включая сбор крови, плазму и разделение буйного пальто, cfDNA и извлечение ДНК зародышей, количественную оценку ДНК cfDNA или зародышевой линии, а также анализ обогащения фрагментов cfDNA.

Introduction

Технологические достижения привели к секвенированию сотен геномов рака и транскриптомов¹. Это способствовало пониманию ландшафтов молекулярных изменений в различных типах рака^2. Дальнейшие исследования этих ландшафтов помогли охарактеризовать последовательные соматические изменения и^{генно-генные слияния 3,} которые участвуют в раке или прогрессировании опухоли, последовательно нарушая пути апоптоза⁴. Таким образом, соматические мутации и генно-генные синтезы могут предоставить информацию об опухолях, выступая в качестве биомаркеров у отдельных^{пациентов для конкретного типа опухоли 5}, выявление существующих первичных^{прогнозов опухоли 6}, классификация вторичных опухолей на^{основе молекулярных изменений 7}, и выявление наркотических целей^{опухоли 8}. Такая информация может способствовать выбору персонализированного лечения онкологических больных и в определении положительных и отрицательных ответов на^{лечение 9.} Однако получение опухолевого материала для выявления геномного профилирования опухолевой ткани является инвазивной^{процедурой 10.} Кроме того, биопсия опухоли состоит лишь из небольшой части неоднородной опухоли; и, следовательно, не может быть репрезентативным для молекулярного профиля всей опухоли¹¹. Серийный мониторинг и генотипирование опухоли требуют повторного сбора опухолевых тканей, что, как правило, не представляется возможным из-за инвазивности процедуры биопсии опухоли и вопросов безопасности, которые возникают в^{результате таких процедур 12}.

Техника жидкой биопсии, с другой стороны, получила огромное внимание в точной онкологии за последнее^{десятилетие 13,14}. Это в основном из-за неинвазивности этого метода, и возможность его повторения в нескольких точках времени, тем самым позволяя простой в использовании и безопасный метод мониторинга для^{курсов болезни 15,16}. Биопсия жидкости основана на явлении, что опухолевые клетки размножаются быстро, и одновременно многие из них проходят апоптоз и некроз. Это приводит к высвобождению апоптотических клеточных обломков в кровь пациентов, а также фрагменты ДНК, которые вырезаны в точных размерах во время апоптоза¹⁷. Апоптоз не раковых клеток также приводит к высвобождению его клеточного мусора в кровь, однако, скорость апоптоза в этих клетках относительно намного ниже, чем опухолевые^{клетки 18}. Рациональным методом жидкой биопсии является захват связанных с опухолью молекул, таких как ДНК, РНК, белки и^{опухолевые клетки 14},^19, которые постоянно циркулируют в крови. Различные^{методы 20} могут быть использованы для анализа этих молекул, включая секвенирование следующего поколения (NGS), цифровую реакцию цепи полимеразы капли (ddPCR), ПЦР в режиме реального времени и связанный с ферментами иммуносорбентный анализ (ELISA). Методика биопсии жидкости позволяет выявлять биомаркеры, которые являются характеристиками опухолевых клеток. Эти молекулы биомаркера высвобождаются не только из определенных частей опухоли, но и из всех частей опухоли^21. Таким образом, маркеры, выявленные в жидкой биопсии представляет собой молекулярное профилирование всей неоднородной опухоли, в дополнение к другим опухолям в организме, таким образом, имея преимущества перед биопсией тканей на^{основе техники 22}.

CfDNA имеет короткий период полу-жизни в циркулирующей крови, начиная от нескольких минут до 1-2 часов²³. Тем не менее, короткое время полуиллиард cfDNA облегчает анализы в режиме реального времени путем оценки реакции лечения и динамических оценок опухоли. Опухолевые уровни cfDNA указывают на прогнозирование стадии/размера опухоли, о чем свидетельствует несколько исследований, которые показали связь между уровнями cfDNA и исходами^{выживания 24}. Кроме того, исследования доказали, что cfDNA имеет лучшую способность прогнозирования, чем существующие маркеры^{опухоли 25}. Прогнозирование cfDNA еще более выраженным после лечения рака, более высокие уровни cfDNA после лечения хорошо коррелирует со снижением скорости выживания, и устойчивость к лечению. Принимая во время, более низкие уровни cfDNA после терапии вообще соответствует с положительной реакцией обработки. Кроме того, cfDNA облегчает раннее выявление ответных мер лечения, чем традиционные методы обнаружения.

cfDNA увеличивает возможность раннего выявления связанных с раком мутаций: во время^{ранней стадии заболевания 15,появление симптомов 26} и до диагностики рака до 2^{лет 27}. Как cfDNA высвобождается из нескольких областей опухоли или очагов, его анализ обеспечивает всеобъемлющее представление генома опухоли он представляет²⁸. Таким образом, cfDNA позволяет обнаружить соматические мутации, которые, возможно, были пропущены в образцах^{тканей 29}. Поскольку внутриохоуловидная неоднородность и субклональные мутации могут быть обнаружены путем глубокого секвенирования геномных областей, охватывающих тысячи баз, следовательно, анализ cfDNA позволяет выявить конкретные молекулярные подтипы с различными геномными^{сигнатурами 13}. Для получения аналогичного уровня информации через образец ткани было бы необходимо много твердых биопсий.

Кроме того, уровни cfDNA у пациентов с локализованным заболеванием, таким как толстой кишки, яичников и рака легких после хирургического лечения и / или химиотерапии, показали, что мощный прогностический маркер для рецидива рака и^{результатов лечения 20}. Кроме того, у пациентов с раком толстой кишки, молочной железы и легких анализы cfDNA из крови могли успешно обнаружить опухолевые изменения, которые привели к точному прогнозированию рецидива за^{несколько месяцев до 13}. Кроме того, маркеры устойчивости к лечению, такие как мутации KRAS у пациентов с CRC, получающих анти-EGFR^{терапию 30;} VAFs для генов, таких как PIK3CA, MED1 или EGFR у пациентов с раком молочной железы после лечения с различными методами^{лечения 31;} и EGFR T790M резистентности мутации у больных раком легких лечение EGFR-целевых^{TKIs 32 также могут} быть определены с помощью анализа cfDNA.

Таким образом, анализ cfDNA может быть использован для выявления точных биомаркеров в области^{онкологии 13,33}. В этом протоколе, образцы крови 3 пациентов глиомы и 3 здоровых контроля были обработаны для получения геномной ДНК из WBCs и cfDNA из плазмы. При раке глиомы мутации в IDH, TERT, ATRX, EGFR и TP53 служат как диагностическими, так и прогностические маркеры, которые могут помочь в ранней диагностике опухолей глиомы, классификации различных типов опухолей глиомы, руководстве точное лечение для отдельного пациента и понимание^{реакции лечения 34,35}. Мутационный статус этих генов можно определить с помощью с помощью сфДНК, полученной из крови. В этой рукописи мы представляем подробный протокол плазменного cfDNA, который был использован для изучения мутационных изменений в раке глиомы¹². Такой протокол жидкой биопсии на основе cfDNA, разъясняясь в этой статье, может быть использован для изучения мутационных изменений во многих других видах рака. Кроме того, недавнее исследование показало, что cfDNA основе жидкой биопсии может обнаружить 50 различных видов рака³⁶.

Сбор образцов крови, хранение и отгрузка являются важными шагами в этом протоколе, так как неконтролируемая температура во время этих шагов вызывает лиз WBCs, что приводит к выпуску геномной ДНК из WBC в плазму и вызывает загрязнение образца cfDNA, который влияет на остальную часть^{процедуры 37}. Гемолиз из-за неконтролируемой температуры может ухудшить вниз по течению процессы подготовки образца cfDNA, такие как ПЦР^{шаги 38}. Сыворотка содержит высокую долю зародышевой cfDNA, а не плазмы, хотя она представляет собой большой фоновый шум для опухолевых cfDNA³⁹. Таким образом, для изоляции опухолевых cfDNA, плазма является подходящим образцом³⁹. Кровь, нарисованная в антикоагулянте, содержащем трубку для сбора крови, должна быть центрифугирована немедленно или в течение двух часов, чтобы отделить плазму и избежать загрязнения cfDNA. В этом протоколе используются специальные коммерческие трубки для сбора крови cfDNA (см. таблицу материалов),которые являются альтернативой антикоагулянту, содержащем трубки для сбора крови. Эти выделенные трубки сбора крови сохраняют cfDNA и cfRNA, и предотвращает лиз WBCs на срок до 30 дней при температуре окружающей среды, и до 8 дней при температуре 37 градусов по Цельсию. Это облегчает поддержание соответствующей температуры во время отгрузки образца крови и до тех пор, пока плазма и WBC разделены⁴⁰.

Есть три типа методов извлечения cfDNA в настоящее время доступны: фазовая изоляция, кремниевая мембрана на основе спина колонки, и магнитной бисером на основе^{изоляции 41}. Силиконовая мембрана на основе спина колонки метод дал большое количество cfDNA с высокой целостностью по сравнению с другими методами извлечения cfDNA⁴².

Количественная оценка ДНК является одним из основных требований в жидкой биопсии, необходимо разработать простую, доступную и стандартизированную процедуру для их легкой реализации и широкого использования. Три широко используемых метода количественной оценки cfDNA являются спектрофотометрические, флюориметрические и qPCR. Фторметрический метод оказался лучше по отношению к другим методам, касающимся точности, стоимости и простоты проведения^43.

Целостность и чистоту cfDNA можно оценить либо по агарозовому электрофорезу, либо по капиллярной электрофорезу. Электрофорез агарозы не показывает чувствительности при низкой концентрации cfDNA и не имеет высокого разрешения, чтобы показать точный размер фрагмента cfDNA. С другой стороны, капиллярный электрофорез имеет преимущество перед электрофорезом агарозы, преодолевая связанные с этим проблемы и, следовательно, широко используемый исследователями для анализа размера фрагмента cfDNA. В этом протоколе распределение размера фрагмента изолированной cfDNA оценивалось с помощью автоматизированного капиллярного электрофореза (см. таблицу материалов).

Protocol

Перед сбором крови требуется информированное согласие субъектов, участвующих в исследовании, которые должны быть получены. Исследование, описанное в этой рукописи, было проведено в соответствии с медицинским центром Рабина, Комитетом по этике Израиля (этический кодекс: 0039-17-RMC) и медиц?…

Representative Results

Разделение плазмы8,5-9 мл крови, собранной в cfDNA или cfRNA консервантных трубок дает около 4 мл плазмы в объеме. Объем плазмы, отделенной от крови, собранной в трубках ЭДТА, может варьироваться в зависимости от температуры. Воздействие EDTA трубки, содержащие кровь при температуре вы…

Discussion

Сбор крови пациента в трубке, отгрузка и хранение являются важными первоначальными шагами в жидкой биопсии. Неправильное обращение может ухудшить качество плазмы и, следовательно, может помешать результатам жидкой биопсии^47. Если образец крови собран в трубке крови ЭДТА, п…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C