Påvisande av cellfritt DNA i blodplasmaprover från cancerpatienter

Summary

I detta dokument presenterar vi ett detaljerat protokoll för icke-invasiv flytande biopsi teknik, inklusive blod insamling, plasma och buffy coat separation, cfDNA och sett DNA extraktion, kvantifiering av cfDNA eller könsceller DNA och cfDNA fragment anrikning analys.

Abstract

Att identifiera mutationer i tumörer hos cancerpatienter är ett mycket viktigt steg i sjukdomshanteringen. Dessa mutationer fungerar som biomarkörer för tumördiagnos samt för behandlingsvalet och dess svar hos cancerpatienter. Den nuvarande guldstandardmetoden för att upptäcka tumörmutationer innebär ett genetiskt test av tumör-DNA med hjälp av tumörbiopsier. Denna invasiva metod är dock svårt att utföras upprepade gånger som ett uppföljningstest av tumör mutational repertoaren. Flytande biopsi är en ny och framväxande teknik för att upptäcka tumörmutationer som en lättanvänd och icke-invasiv biopsi strategi.

Cancerceller förökar sig snabbt. Parallellt genomgår många cancerceller apoptos. Skräp från dessa celler släpps ut i patientens cirkulationssystem, tillsammans med fint fragmenterade DNA-bitar, så kallade cellfria DNA-fragment (cfDNA), som bär tumör-DNA-mutationer. För att identifiera cfDNA-baserade biomarkörer med hjälp av flytande biopsiteknik samlas därför blodprover in från cancerpatienterna, följt av separation av plasma och buffy coat. Därefter bearbetas plasma för isolering av cfDNA, och respektive buffy coat bearbetas för isolering av en patients genomiska DNA. Båda nukleinsyraproverna kontrolleras sedan för sin kvantitet och kvalitet. och analyseras för mutationer med hjälp av nästa generations sekvenseringstekniker (NGS).

I detta manuskript presenterar vi ett detaljerat protokoll för flytande biopsi, inklusive blodsamling, plasma och buffy coat separation, cfDNA och könsceller DNA extraktion, kvantifiering av cfDNA eller könsceller DNA och cfDNA fragment anrikning analys.

Introduction

Tekniska framsteg har lett till sekvensering av hundratals cancergenom och transkriptomer¹. Detta har bidragit till att förstå landskap av molekylära förändringar över olika cancertyper². Ytterligare studier på dessa landskap har hjälpt till att karakterisera sekventiella somatiska förändringar och gen-genfusioner³ som är involverade i cancer eller tumörprogression, genom att seriellt störa apoptosvägar⁴. Därför kan somatiska mutationer och gen-genfusioner ge information om tumörer genom att fungera som biomarkörer hos enskilda patienter för en viss tumör^{typ 5}, identifiera befintliga primära tumörer prognos⁶, kategorisera sekundära tumörer baserat på molekylära^{förändringar 7}, och identifiera druggable tumör mål⁸. Sådan information kan underlätta vid val av personlig behandling för cancerpatienter och vid bestämning av positiva och negativa behandlingssvar⁹. Emellertid, erhålla tumör material för att identifiera genomisk profilering av tumörvävnad är ett invasivt förfarande¹⁰. Dessutom omfattar en tumör biopsi endast en liten del av en heterogen tumör. och kan därför inte vara representativ för den molekylära profilen för hela^{tumören 11}. Seriell övervakning och tumör genotypning kräver en upprepad samling av tumör vävnader, vilket vanligtvis inte är genomförbart på grund av invasiviteten i tumör biopsi förfarande och de säkerhetsproblem som uppstår från sådana^{förfaranden 12}.

Den flytande biopsitekniken, å andra sidan, har fått enorm uppmärksamhet i precision onkologi under det senaste decenniet^13,14. Det beror främst på den icke-invasiva tekniken, och möjligheten att den upprepas vid flera tidpunkter, vilket möjliggör en lättanvänd och säker övervakningsteknik för sjukdomskurserna^15,16. Flytande biopsi är baserad på ett fenomen som tumörceller multiplicerar snabbt, och samtidigt genomgår många av dem apoptos och nekros. Detta leder till frisättning av apoptotiskt cellskräp i patienternas blod, tillsammans med DNA-fragmenten som skärs i exakta storlekar under apoptos¹⁷. Apoptosen hos icke-cancerceller leder också till att dess cellulära skräp släpps ut i blodet, men apoptoshastigheten i dessa celler är relativt mycket lägre än tumörceller¹⁸. Den rationella av den flytande biopsitekniken är att fånga tumörrelaterade molekyler som DNA, RNA, proteiner och tumörceller^14,19 som cirkulerar kontinuerligt i blodet. Olika tekniker²⁰ kan användas för analys av dessa molekyler inklusive nästa generations sekvensering (NGS), digital dropppolymeraskedjereaktion (ddPCR), PCR i realtid och enzymlänkad immunosorbentanalys (ELISA). Flytande biopsiteknik gör det möjligt att identifiera biomarkörer som är egenskaper hos tumörceller. Dessa biomarkörmolekyler frigörs inte bara från specifika delar av en tumör, utan snarare från alla delar av^{tumören 21}. Därför representerar markörer som identifierats i flytande biopsi molekylär profilering av en hel heterogen tumör, förutom andra tumörer i kroppen, vilket har fördelar jämfört med vävnad biopsi-baserade tekniken²².

CfDNA har en kort halveringstid i det cirkulerande blodet som sträcker sig från några minuter till 1-2 timmar²³. Den korta halveringstiden för cfDNA underlättar dock realtidsanalyser genom att utvärdera behandlingssvar och dynamiska tumörbedömningar. Tumör-härledda cfDNA nivåer indikerar prognostication av tumör stadium/storlek framgår av flera studier, som visade ett samband mellan cfDNA nivåer och överlevnad resultaten²⁴. Dessutom har studier visat att cfDNA har en bättre prediktionskapacitet än befintliga tumörmarkörer²⁵. Prognosen för cfDNA är ännu mer uttalad efter cancerbehandling, högre nivåer av cfDNA efter behandling korrelerar väl med en minskad överlevnadsgrad och resistens mot behandling. Medan lägre nivåer av cfDNA efter behandling i allmänhet motsvarar positivt behandlingssvar. Dessutom underlättar cfDNA tidig upptäckt av behandlingssvar än de traditionella detektionsmetoderna.

CfDNA ökar möjligheten till tidig upptäckt av cancerrelaterade mutationer: under tidig sjukdom¹⁵, uppkomsten av symtom^{26 och} före cancerdiagnos upp till 2 år²⁷. Eftersom cfDNA frigörs från flera tumörregioner eller högborgar ger analysen en omfattande bild av tumörgenomet det representerar²⁸. Därför gör cfDNA det möjligt att upptäcka somatiska mutationer som kan ha missats i vävnadsproverna²⁹. Som intra-tumor heterogenitet och subklonala mutationer kan detekteras genom djup sekvensering av genomiska regioner som spänner över tusentals baser, gör analysen av cfDNA det möjligt att avslöja specifika molekylära subtyper med distinkta genomiska signaturer¹³. För att få en liknande informationsnivå genom vävnadsprov skulle många fasta tarmbiopsier ha behövts.

Dessutom visade cfDNA nivåer hos patienter med en lokaliserad sjukdom såsom kolon, äggstockscancer och lungcancer efter en kirurgisk behandling och/eller kemoterapi, vara en kraftfull prognostiska markör för cancer återkommande och behandling resultat²⁰. Dessutom, hos patienter med tjocktarms-, bröst- och lungcancer, kunde analyser av cfDNA från blodet framgångsrikt upptäcka de tumörspecifika förändringarna, vilket ledde till den exakta förutsägelsen av återkommande flera månader i förväg¹³. Dessutom markörer för behandlingsresistens, såsom KRAS-mutationer hos patienter med CRC som får anti-EGFR-behandling³⁰; VAFs för gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos patienter med bröstcancer efter behandlingen med olika terapier³¹; och EGFR T790M resistensmutation hos lungcancerpatienter som behandlats med EGFR-riktade TKIs³² kan också identifieras genom cfDNA-analys.

Sammanfattningsvis kan cfDNA-analysen användas för att identifiera exakta biomarkörer inom onkologi^13,33. I detta protokoll behandlades blodprover från 3 gliompatienter och 3 friska kontroller för att erhålla genomiskt DNA från WBC och cfDNA från plasman. Vid gliomcancer fungerar mutationer i IDH, TERT, ATRX, EGFR och TP53 som en diagnostisk samt prognostiska markörer som kan hjälpa till vid tidig diagnos av gliomtumörer, klassificera olika typer av gliomtumörer, vägleda den exakta behandlingen för den enskilda patienten och förstå behandlingssvaret^34,35. Mutationsstatus för dessa gener kan identifieras med hjälp av blod-härledda cfDNA. I detta manuskript presenterar vi ett detaljerat protokoll av plasma-härledda cfDNA som har använts för att studera mutationella förändringar i gliom cancer¹². Sådana cfDNA-baserade flytande biopsi protokoll förklaras i denna artikel kan användas för att studera mutationella förändringar i många andra typer av cancer. Dessutom har en ny studie visat att cfDNA-baserad flytande biopsi kan upptäcka 50 olika typer av cancer³⁶.

Insamling, lagring och sändning av blodprover är avgörande steg i detta protokoll, eftersom okontrollerad temperatur under dessa steg orsakar lys av WBC, vilket leder till att genomiskt DNA frigörs från WBC i plasman och orsakar förorening av cfDNA-provet, vilket påverkar resten av^{proceduren 37}. Hemolys på grund av okontrollerad temperatur kan försämra nedströms provberedningsprocesser av cfDNA, såsom PCR steg³⁸. Serumet innehåller en hög andel sett till cfDNA snarare än plasma, även om det presenterar ett stort bakgrundsljud för tumör-associerade cfDNA³⁹. Därför, för att isolera tumör-associerade cfDNA, plasma är ett lämpligt prov³⁹. Blod som dras i ett antikoagulantia som innehåller bloduppsamlingsrör ska centrifugeras omedelbart eller inom upp till två timmar, för att separera plasman och för att undvika cfDNA-kontaminering. I detta protokoll används dedikerade kommersiella cfDNA konserveringsrör för blodsamling (se Materialförteckning),som är ett alternativ till antikoagulantia som innehåller bloduppsamlingsrör. Dessa dedikerade bloduppsamlingsrör bevarar cfDNA och cfRNA och förhindrar lys av WBC i upp till 30 dagar vid omgivningstemperatur och upp till 8 dagar vid 37 °C. Detta underlättar bibehållandet av lämplig temperatur under en blodprovstransport och tills plasma och WBC separeras⁴⁰.

Det finns för närvarande tre typer av cfDNA-extraktionsmetoder: fasisolering, kiselmembranbaserad spinnkolonn och magnetisk pärlbaserad isolering⁴¹. Den kiselmembranbaserade spinnkolonnmetoden gav en hög mängd cfDNA med hög integritet jämfört med andra cfDNA-extraktionsmetoder⁴².

Den kvantitativa utvärderingen av DNA är ett grundläggande krav inom flytande biopsi, det finns ett behov av att utveckla ett enkelt, överkomligt och standardiserat förfarande för deras enkla implementering och breda användning. Tre vanliga metoder för cfDNA kvantifiering är spektrofotometriska, fluorimetriska och qPCR. Den fluorimetriska metoden har visat sig vara bättre än de andra metoderna för noggrannhet, kostnad och enkel ledning⁴³.

CfDNA: s integritet och renhet kan uppskattas av antingen agarose elektrofores eller kapillär elektrofores. Agarose elektrofores visar varken känslighet vid låg koncentration av cfDNA eller har hög upplösning för att visa exakt fragmentstorlek av cfDNA. Å andra sidan har kapillärelektrofores en fördel jämfört med agaroseelektroforesen genom att övervinna de tillhörande utmaningarna och därför allmänt använda av forskarna för cfDNA fragmentstorleksanalys. I detta protokoll uppskattades fragmentstorleksfördelningen av isolerade cfDNA med hjälp av ett automatiserat kapillärelektroforesinstrument (se Materialförteckning ).

Protocol

Före blodinsamling krävs informerat samtycke från försökspersoner som deltar i forskningen och måste erhållas. Forskningen som beskrivs i detta manuskript utfördes i enlighet med och överensstämmelse med Rabin Medical Center, Israels etikkommitté (etikkod: 0039-17-RMC) och medicinska fakulteten Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Tysklands etikkommitté (etikkod: D 405/14). 1. Insamling och lagring av blodprover i cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrör Märk konser…

Representative Results

Plasmaseparation8,5-9 ml blod som samlats in i cfDNA- eller cfRNA-konserveringsrör ger cirka ~4 ml plasma i volym. Mängden plasma som separeras från blod som samlats in i EDTA-rör kan variera beroende på temperaturen. Exponering av EDTA-rör som innehåller blod vid en temperatur över 37 °C leder till minskadplasmavolymutbyte 44. Resultat av fluorometeranalyscfDNA koncentration i 1 ml plasma av var och en av glioma patien…

Discussion

Insamling av en patients blod i ett rör, transport och lagring är avgörande inledande steg i flytande biopsi. Felaktig hantering kan försämra plasmans kvalitet och kan därför störa resultaten av den flytande biopsin⁴⁷. Om ett blodprov samlas in i ett EDTA-blodrör måste plasman separeras inom två timmar efter blodinsamlingen för att undvika lys av WBC och frisättning av dess genomiska DNA i plasma⁴⁸. WBC kan också genomgå apoptos i ett EDTA-rör om det förvar…

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C