Påvisning av cellefritt DNA i blodplasmaprøver av kreftpasienter

Summary

I dette papiret presenterer vi en detaljert protokoll for ikke-invasiv flytende biopsiteknikk, inkludert blodinnsamling, plasma- og buffycoatseparasjon, cfDNA og germline DNA-ekstraksjon, kvantifisering av cfDNA eller germline DNA, og cfDNA fragmentberikelsesanalyse.

Abstract

Identifisering av mutasjoner i svulster hos kreftpasienter er et svært viktig skritt i sykdomsbehandling. Disse mutasjonene tjener som biomarkører for tumordiagnose, så vel som for behandlingsvalget og dens respons hos kreftpasienter. Den nåværende gullstandardmetoden for å oppdage tumormutasjoner innebærer en genetisk test av tumor-DNA ved hjelp av tumorbiopsier. Imidlertid er denne invasive metoden vanskelig å bli utført gjentatte ganger som en oppfølgingstest av tumormutasjonsrepertoaret. Flytende biopsi er en ny og fremvoksende teknikk for å oppdage tumormutasjoner som en brukervennlig og ikke-invasiv biopsitilnærming.

Kreftceller multipliserer raskt. Parallelt gjennomgår mange kreftceller apoptose. Rusk fra disse cellene slippes ut i pasientens sirkulasjonssystem, sammen med fint fragmenterte DNA-stykker, kalt cellefrie DNA -fragmenter (cfDNA), som bærer tumor-DNA-mutasjoner. Derfor, for å identifisere cfDNA-baserte biomarkører ved hjelp av flytende biopsiteknikk, samles blodprøver fra kreftpasientene, etterfulgt av separasjon av plasma og buffy pels. Deretter behandles plasma for isolering av cfDNA, og den respektive buffy pelsen behandles for isolering av pasientens genomiske DNA. Begge nukleinsyreprøvene kontrolleres deretter for deres kvantitet og kvalitet; og analysert for mutasjoner ved hjelp av neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS).

I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert protokoll for flytende biopsi, inkludert blodinnsamling, plasma og buffy coat separasjon, cfDNA og germline DNA ekstraksjon, kvantifisering av cfDNA eller germline DNA, og cfDNA fragment berikelse analyse.

Introduction

Teknologiske fremskritt har ført til sekvensering av hundrevis av kreftgenomer og transkripsjoner¹. Dette har bidratt til å forstå landskap av molekylære endringer på tvers av ulike krefttyper². Videre studier på disse landskapene har bidratt til å karakterisere sekvensielle somatiske endringer og gengenfusjoner³ som er involvert i kreft eller tumorprogresjon, ved å forstyrre apoptoseveier⁴. Derfor kan somatiske mutasjoner og gengenfusjoner gi informasjon om svulster ved å tjene som biomarkører hos individuelle pasienter for en bestemt tumortype⁵, identifisere eksisterende primære svulster prognose⁶, kategorisere sekundære svulster basert på^{molekylære endringer 7}, og identifisere druggable tumor mål⁸. Slik informasjon kan legge til rette for å velge personlig behandling for kreftpasienter og ved fastsettelse av positive og negative behandlingsresponser⁹. Imidlertid er det å skaffe tumormateriale for å identifisere genomisk profilering av tumorvev en invasiv prosedyre¹⁰. Videre består en tumorbiopsi bare en liten del av en heterogen svulst; og kan derfor ikke være representativ for den molekylære profilen til hele svulsten¹¹. Seriell overvåking og tumorgenomtyping krever en gjentatt samling av tumorvev, som vanligvis ikke er mulig på grunn av invasiviteten av tumorbiopsiprosedyre og sikkerhetsproblemene som oppstår fra slike prosedyrer¹².

Den flytende biopsiteknikken, derimot, har fått enorm oppmerksomhet i presisjononkologi det siste tiåret^13,14. Det skyldes hovedsakelig ikke-invasivitet av denne teknikken, og muligheten for at den gjentas på flere tidspunkter, og dermed muliggjør en brukervennlig og sikker overvåkingsteknikk for sykdomskursene^15,16. Flytende biopsi er basert på et fenomen som tumorceller multipliserer raskt, og samtidig gjennomgår mange av dem apoptose og nekrose. Dette fører til frigjøring av apoptotisk celleavfall i pasientens blod, sammen med DNA-fragmentene som kuttes i nøyaktige størrelser under apoptose¹⁷. Apoptose av ikke-kreftceller fører også til frigjøring av cellulære rusk i blodet, men apoptosehastigheten i disse cellene er relativt mye lavere enn tumorceller¹⁸. Rasjonaliteten av den flytende biopsiteknikken er å fange tumorrelaterte molekyler som DNA, RNA, proteiner og tumorceller^14,19 som sirkulerer kontinuerlig i blodet. Ulike^{teknikker 20} kan brukes til analyse av disse molekylene, inkludert neste generasjons sekvensering (NGS), digital dråpepolymerasekjedereaksjon (ddPCR), sanntids PCR og enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Flytende biopsi teknikk gjør det mulig å identifisere biomarkører som er kjennetegn på tumorceller. Disse biomarkørmolekylene frigjøres ikke bare fra bestemte deler av en svulst, men heller fra alle deler av svulsten²¹. Derfor representerer markører identifisert i flytende biopsi molekylær profilering av en hel heterogen svulst, i tillegg til andre svulster i kroppen, og dermed har fordeler over vevbiopsibasert teknikk²².

CfDNA har en kort halveringstid i det sirkulerende blodet fra noen få minutter til 1-2 timer²³. Den korte halveringstiden til cfDNA forenkler imidlertid sanntidsanalyser ved å evaluere behandlingsrespons og dynamiske tumorvurderinger. Tumoravledede cfDNA-nivåer indikerer prognostisering av tumorstadium/størrelse som fremgår av flere studier, som viste en sammenheng mellom cfDNA-nivåer og overlevelsesresultatene²⁴. Videre har studier vist at cfDNA har en bedre prediksjonskapasitet enn eksisterende tumormarkører²⁵. Prognosen for cfDNA er enda mer uttalt etter kreftbehandling, høyere nivåer av cfDNA etter behandling korrelerer godt med redusert overlevelsesrate og motstand mot behandling. Mens lavere nivåer av cfDNA etter behandling generelt tilsvarer positiv behandlingsrespons. I tillegg forenkler cfDNA tidlig påvisning av behandlingsrespons enn de tradisjonelle deteksjonsmetodene.

CfDNA øker muligheten for tidlig påvisning av kreftrelaterte mutasjoner: under tidlig stadium sykdom¹⁵, utbruddet av symptomer²⁶ og før kreftdiagnose opptil 2 år²⁷. Som cfDNA frigjøres fra flere tumorregioner eller foci, gir analysen et omfattende syn på tumorgenomet det representerer²⁸. Derfor gjør cfDNA det mulig å oppdage somatiske mutasjoner som kan ha blitt savnet i vevsprøvene²⁹. Som intra-tumor heterogenitet og subklonale mutasjoner kan oppdages ved dyp sekvensering av genomiske regioner som strekker seg over tusenvis av baser, derav analysen av cfDNA gjør det mulig å avdekke spesifikke molekylære undertyper med distinkte genomiske^{signaturer 13}. For å få et lignende nivå av informasjon gjennom vevsprøve mange faste biopsier ville ha vært nødvendig.

Videre viste cfDNA-nivåene hos pasienter med en lokalisert sykdom som tykktarm, eggstokk og lungekreft etter kirurgisk behandling og/ eller kjemoterapi, å være en kraftig prognostisk markør for tilbakefall av kreft og behandlingsutfall²⁰. Videre, hos pasienter med tykktarms-, bryst- og lungekreft, kan analyser av cfDNA fra blodet med hell oppdage de tumorspesifikke endringene, noe som førte til den nøyaktige forutsigelsen av tilbakefall flere måneder i forveien¹³. Videre, behandlingsresistensmarkører, slik som KRAS mutasjoner hos pasienter med CRC mottar anti-EGFR terapi³⁰; VAFs for gener som PIK3CA, MED1 eller EGFR hos pasienter med brystkreft etter behandling med ulike behandlinger³¹; og EGFR T790M resistensmutasjon hos lungekreftpasienter behandlet med EGFR-målrettede TKIer³² kan også identifiseres ved cfDNA-analyse.

Oppsummert kan cfDNA-analysen brukes til å identifisere nøyaktige biomarkører innen onkologi^13,33. I denne protokollen ble blodprøver av 3 gliompasienter og 3 friske kontroller behandlet for å oppnå genomisk DNA fra WBCer og cfDNA fra plasmaet. I gliomakreft fungerer mutasjoner i IDH, TERT, ATRX, EGFR og TP53 som en diagnostisk samt prognostiske markører som kan hjelpe til med tidlig diagnose av gliomasvulster, klassifisere ulike typer gliomasvulster, veilede nøyaktig behandling for den enkelte pasient og forstå behandlingsresponsen^34,35. Mutasjonsstatus for disse genene kan identifiseres ved hjelp av blodavledet cfDNA. I dette manuskriptet presenterer vi en detaljert protokoll av plasma-avledet cfDNA som har blitt brukt til å studere mutasjonsendringer i gliomakreft¹². Slike cfDNA-baserte flytende biopsiprotokoll forklart i denne artikkelen kan brukes til å studere mutasjonsendringer i mange andre typer kreftformer. Videre har en nylig studie vist at cfDNA-basert flytende biopsi kan oppdage 50 forskjellige typer kreft³⁶.

Blodprøveinnsamling, lagring og forsendelse er avgjørende trinn i denne protokollen, da ukontrollert temperatur under disse trinnene forårsaker lysis av WBCer, noe som fører til frigjøring av genomisk DNA fra WBC inn i plasmaet og forårsaker forurensning av cfDNA-prøven, noe som påvirker resten av prosedyren³⁷. Hemolyse på grunn av ukontrollert temperatur kan svekke nedstrøms prøveforberedelsesprosesser av cfDNA, for eksempel PCR trinn³⁸. Serumet inneholder en høy andel av germline cfDNA i stedet for plasma, selv om det presenterer en stor bakgrunnsstøy for tumor-assosiert cfDNA³⁹. Derfor, for å isolere tumor-assosiert cfDNA, plasma er en passende prøve³⁹. Blod som trekkes i et antikoagulant som inneholder blodoppsamlingsrør, bør sentrifugeres umiddelbart eller innen opptil to timer, for å skille plasmaet og for å unngå cfDNA-kontaminering. I denne protokollen brukes dedikerte kommersielle cfDNA bevaring blodinnsamlingsrør (se Materialse tabell), som er et alternativ til antikoagulant som inneholder blodinnsamlingsrør. Disse dedikerte blodinnsamlingsrørene bevarer cfDNA og cfRNA, og forhindrer lysis av WBCer i opptil 30 dager ved omgivelsestemperatur, og opptil 8 dager ved 37 °C. Dette forenkler opprettholdelse av riktig temperatur under en blodprøve forsendelse og til plasma og WBC er skilt⁴⁰.

Det finnes tre typer cfDNA utvinning metoder tilgjengelig: faseisolasjon, silisium-membran basert spin kolonne, og magnetisk perle-basert isolasjon⁴¹. Den silisiummembranbaserte spin-kolonnemetoden ga en høy mengde cfDNA med høy integritet sammenlignet med andre cfDNA-ekstraksjonsmetoder⁴².

Den kvantitative evalueringen av DNA er et grunnleggende krav i flytende biopsi, det er behov for å utvikle en enkel, rimelig og standardisert prosedyre for enkel implementering og bred bruk. Tre vanlige metoder for cfDNA-kvantifisering er spektrofotometriske, fluoriske og qPCR. Den fluorometriske metoden er bevist bedre over de andre metodene om nøyaktighet, kostnad og enkel ledning⁴³.

Integriteten og renheten til cfDNA kan estimeres ved enten agarose elektroforese eller kapillær elektroforese. Agarose elektroforese viser verken følsomhet ved lav konsentrasjon av cfDNA eller har høy oppløsning for å vise nøyaktig fragmentstørrelse av cfDNA. På den annen side har kapillær elektroforese en fordel over agarose elektroforesen ved å overvinne de tilknyttede utfordringene og derfor mye brukt av forskerne for cfDNA fragmentstørrelsesanalyse. I denne protokollen ble fragmentstørrelsesfordelingen av isolert cfDNA estimert ved hjelp av et automatisert kapillærelektroforeseinstrument (se Materials tabell).

Protocol

Før blodinnsamling er det nødvendig med informert samtykke fra personer som deltar i forskningen og må innhentes. Forskningen beskrevet i dette manuskriptet ble utført i samsvar med Rabin Medical Center, Israel etikk komité (etikk kode: 0039-17-RMC) og Det medisinske fakultet Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Tyskland etikk komité (etikk kode: D 405/14). 1. Blodprøveinnsamling og lagring i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddelrør Merk bevaringsrørene riktig …

Representative Results

Separasjon av plasma8,5-9 ml blod samlet i cfDNA eller cfRNA konserveringsmiddelrør gir rundt ~ 4 ml plasma i volum. Volumet av plasma atskilt fra blod samlet i EDTA-rør kan variere avhengig av temperaturen. Eksponering av EDTA-rør som inneholder blod ved en temperatur høyere enn 37 °C fører til redusert plasmavolumutbytte44. Fluoranalyse ResultatercfDNA konsentrasjon i 1 ml plasma av hver av glioma pasienter #1 og #3 og f…

Discussion

Innsamlingen av pasientens blod i et rør, forsendelse og lagring er avgjørende første skritt i flytende biopsi. Feil håndtering kan svekke kvaliteten på plasmaet og derfor kan forstyrre resultatene av den flytende biopsien⁴⁷. Hvis en blodprøve samles inn i et EDTA-blodrør, må plasmaet separeres innen to timer etter blodinnsamling for å unngå lysis av WBCer og frigjøring av genomisk DNA i plasma⁴⁸. WbCs kan også gjennomgå apoptose i et EDTA-rør hvis det holdes …

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	The 2100 Bioanalyzer system is an established automated electrophoresis tool for the sample quality control of biomolecules.
Adjustable Clip for Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Used in combination with syringe to apply defined pressure for chip priming.
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent Technologies, Inc.	5067-4626	The High Sensitivity DNA assays are often used for sample quality control for next-generation sequencing libraries
cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes	Norgen Biotek Corp.	63950	Norgen's cf-DNA/cf-RNA Preservative Tubes are closed, evacuated plastic tubes for the collection and the preservation of cf-DNA, circulating tumor DNA, cf-RNA and circulating tumor cells in human whole blood samples during storage and shipping
Chip Priming Station	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Used to load gel matrix into a chip with a syringe provided with each assay kit— used for RNA, DNA, and protein assays. Includes priming station, stop watch, and 1 syringe clip
Electrode Cleaner Kit	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Prevents cross-contamination. Removes bacterial or protein contaminants from electrodes.
Filters for Gel Matrix	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Used for proper mixing of DNA dye concentrate and DNA gel matrix
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Used for proper mixing of DNA ladder and DNA sample on Bioanalyzer assay chips
NucleoSpin Tissue kit	MACHEREY-NAGEL	740952.5	With the NucleoSpin Tissue kit, genomic DNA can be prepared from tissue, cells (e.g., bacteria), and many other sources.
QIAamp circulating nucleic acid kit	Qiagen	55114	The QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit enables efficient purification of these circulating nucleic acids from human plasma or serum and other cell-free body fluids.
QIAvac 24 Plus vacuum manifold	Qiagen	19413	The QIAvac 24 Plus vacuum manifold is designed for vacuum processing of QIAGEN columns in parallel.
QIAvac Connecting System	Qiagen	19419	In combination with the QIAvac Connecting System, the QIAvac 24 Plus vacuum manifold can be used as a flow-through system. The sample flow-through, containing possibly infectious material, is collected in a separate waste bottle.
Qubit 2.0 fluorometer	Invitrogen	Q32866	The Qubit 2.0 Fluorometer is an easy-to-use, analytical instrument designed to work with the Qubit assays for DNA, RNA, and protein quantitation.
Qubit assay tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Qubit assay tubes are 500 µL thin-walled polypropylene tubes for use with the Qubit Fluorometer.
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32851	The Qubit dsDNA HS (High Sensitivity) Assay Kit is designed specifically for use with the Qubit Fluorometer. The assay is highly selective for double-stranded DNA (dsDNA) over RNA and is designed to be accurate for initial sample concentrations from 10 pg/µL to 100 ng/µL.
Vacuum Pump	Qiagen	84010	used for vacuum processing of QIAGEN columns
Miscellaneous
50 ml centrifuge tubes
Crushed ice
Ethanol (96–100%)
Heating block or similar at 56 °C (capable of holding 2 ml collection tubes)
Isopropanol (100%)
Microcentrifuge
Phosphate-buffered saline (PBS)
Pipettes (adjustable)
Sterile pipette tips (pipette tips with aerosol barriers are recommended to help prevent cross-contamination)
Water bath or heating block capable of holding 50 mL centrifuge tubes at 60 °C