Quantificação da área de adesão de substrato celular e distribuições de formas celulares em monocamadas de células MCF7
Summary
O artigo descreve a quantificação de 1) o tamanho e o número de aderências focais e 2) índice de forma celular e sua distribuição a partir de imagens confocal das monocamadas confluentes das células MCF7.
Abstract
Os métodos aqui apresentados quantificam alguns parâmetros de monocamadas de células aderirentes confluentes de múltiplas imagens confocais adequadamente manchadas: adesão ao substrato em função do número e tamanho das aderências focais, e forma celular, caracterizada pelo índice de forma celular e outros descritores de forma. As aderências focais foram visualizadas pela coloração de paxillin e as bordas das células celulares foram marcadas pela plakoglobina de junção e actina. Os métodos de cultura celular e coloração eram padrão; as imagens representam planos focais únicos; a análise de imagens foi realizada utilizando-se software de processamento de imagens disponível publicamente. Os protocolos apresentados são usados para quantificar o número e o tamanho das aderências focais e as diferenças na distribuição de formas celulares nas monocamadas, mas podem ser reaproveitados para a quantificação do tamanho e forma de qualquer outra estrutura celular distinta que possa ser manchada (por exemplo, mitocôndrias ou núcleos). Avaliar esses parâmetros é importante na caracterização das forças dinâmicas na camada celular aderente, incluindo adesão celular e contratilidade de actomyosina que afeta a forma celular.
Introduction
As monocamadas de células epiteliais atuam como um coletivo no qual a adesão célula-célula e substrato de células, bem como forças e tensões contratuais representam parâmetros importantes e seu equilíbrio adequado contribui para a integridade geral da unidade1,,2,,3. Assim, avaliar esses parâmetros representa uma forma de estabelecer o estado atual da camada celular.
Os dois métodos descritos aqui representam uma análise bidimensional das monocamadas confluentes de células epiteliais aderentes (neste caso, linha de células cancerígenas de mama MCF7). A análise é realizada utilizando-se imagens confocal (fatias Z únicas) de diferentes regiões do eixo Z; região basal perto de um substrato para medições de adesão focal (FA) e região apical para medições de forma celular. Os métodos apresentados são relativamente simples e requerem técnicas de laboratório padrão e software de código aberto. A microscopia confocal é suficiente para este protocolo, por isso pode ser realizada sem empregar microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total (Fluorescência Interna Total). Assim, o protocolo poderia ser implementado em um ambiente de laboratório relativamente padrão. Embora a precisão dos métodos seja limitada, eles podem distinguir diferenças básicas na adesão focal e na forma celular.
Ambos os métodos descritos aqui consistem nos procedimentos experimentais padrão, como cultivo de células, imunostaining, imagem confocal e análise de imagem realizadas por meio do ImageJ. No entanto, qualquer software de processamento de imagem com as funções apropriadas pode ser usado. Os métodos apresentados podem rastrear e comparar alterações infligidas pelo tratamento farmacológico ou modificação genética mínima. A obtenção de valores definidos não é recomendada, devido à precisão limitada desses métodos. Duas macros automatizadas foram incluídas, para facilitar as medições de muitas imagens.
Protocol
Representative Results
Discussion
A adesão célula-célula e substrato celular constituem atributos inerentes às células epiteliais e desempenham o papel crítico na morfogênese tecidual e embriogênese. Nos tecidos adultos, a regulação adequada das propriedades mecânicas da camada celular é crucial na manutenção da homeostase e na prevenção de respostas patológicas como progressão do tumor e metástase. O tamanho e o número de aderências focais dependem da força da adesão do substrato celular, enquanto a forma celular depende das forç…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciência polonês sob a concessão nº 2014/14/M/NZ1/00437.
Materials
| Alexa Fluor 594 | ThermoFisher Scientific | A32740 | goat anti-rabbit, 1:500 |
| Ammonium chloride | Sigma | A9434 | |
| BSA | BioShop | ALB001.500 | |
| Collagen from calf skin | Sigma | C9791-10MG | |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1:10000 (stock 1 mg/mL in H2O), nucleic acid staining |
| DMEM + GlutaMAX, 1 g/L D-Glucose, Pyruvate | ThermoFisher Scientific | 21885-025 | |
| FBS | ThermoFisher Scientific | 10270-136 | |
| Junction plakoglobin | Cell Signaling | 2309S | rabbit, 1:400 |
| Laminar-flow cabinet class 2 | Alpina | standard equipment | |
| MCF7-basedHAX1KD cell line | Cell line established in the National Institute of Oncology, Warsaw, described in Balcerak et al., 2019 | MCF7 cell line withHAX1knockdown | |
| MCF7 cell line (CONTROL) | ATCC | ATCC HTB-22 | epithelial, adherent breast cancer cell line |
| Olympus CK2 light microscope | Olympus | ||
| Paxillin | Abcam | ab32084 | rabbit, 1:250, Y113 |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Phalloidin-TRITC conjugate | Sigma | P1951 | 1:400 (stock 5 mg/mL in DMSO), actin labeling |
| PTX | Sigma | T7402-1MG | |
| TBST – NaCl | Sigma | S9888 | |
| TBST – Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-11 | |
| Zeiss LSM800 Confocal microscope | Zeiss |
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