En murinmodell av fosterexponering för moderns inflammation för att studera effekterna av akut chorioamnionitis på nyfödda tarmutveckling

Summary

Vi utvecklade en modell av chorioamnionitis för att simulera fetala exponering för moderns inflammation (FEMI) utan komplikationer av levande organismer för att undersöka effekterna av FEMI på utvecklingen av avkommans tarmkanalen. Detta möjliggör studier av mekanistiska orsaker till utveckling av tarmskada efter chorioamnionitis.

Abstract

Chorioamnionitis är en vanlig fällning av prematur födsel och är associerad med många av sjukligheterna av prematurity, inklusive necrotizing enterocolitis (NEC). En mekanistisk koppling mellan dessa två villkor återstår dock att upptäcka. Vi har antagit en murin modell av chorioamnionitis omfattar lipopolysackarid (LPS)-inducerad fetala exponering för moderns inflammation (FEMI). Denna modell av FEMI inducerar en steril moderns, placenta och fetala inflammatoriska kaskad, som också finns i många fall av klinisk chorioamnionitis. Även om modeller finns som använder levande bakterier och mer exakt efterliknar patofysiologin hos en stigande infektion som resulterar i chorioamnionitis, kan dessa metoder orsaka indirekta effekter på utvecklingen av det omogna tarmkanalen och det tillhörande utvecklande mikrobiomet. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att LPS-inducerad FEMI resulterar i en dosberoende ökning av graviditetsförlust och prematur födsel, samt störningar av normal tarmutveckling hos avkommor. Vidare har vi visat att FEMI avsevärt ökar tarmskada och serumcytokiner hos avkommor, samtidigt som bägare och Paneth-celler minskar, som båda ger en första rad av medfödd immunitet mot tarminflammation. Även om en liknande modell av LPS-inducerad FEMI har använts för att modellera associeringen mellan chorioamnionitis och efterföljande avvikelser i centrala nervsystemet, till vår kunskap, är detta protokoll den första att försöka klargöra en mekanistisk länk mellan chorioamnionitis och senare störningar i tarmutveckling som en potentiell länk mellan chorioamnionitis och NEC.

Introduction

De chorionic membranen spelar en integrerad roll i däggdjur graviditet. De inkluderar chorion och amnion, som tjänar flera funktioner. De omger och skyddar fostret, underlättar parakrina signalering mellan moderns och fostrets^{fack 1}, och skapar lokala återkopplingsöglor i de korrioniska membranen, som kan vara involverade i att initiera förlossning¹. Nuvarande förståelse av membranen indikerar att amnion ger strukturell barriärfunktion, och chorion ger en immunologisk buffert främst för att skydda det utvecklande fostret från moderns immunsystem². Inflammation i dessa membran är känd som chorioamnionitis. Historiskt gjordes diagnos av kliniska chorioamnionitis efter förekomsten av moderns feber plus en eller flera fetala eller moderns kliniska resultat^3,4. Men även om denna definition är kliniskt användbar, dess brist på precision har gjort chorioamnionitis forskning utmanande. I ett försök att klargöra diagnosen definierade eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development chorioamnionitis som intrauterin inflammation eller infektion, eller båda (trippel I)³. Detta klargörande är viktigt eftersom medan mikrobiell inducerad infektion är en viktig orsak till livmoder/fosterhinneinflammation, förekommer det mindre vanligt än steril livmoder/fosterhinnan inflammation^5,6,7. Sammantaget är chorioamnionitis fortfarande ett betydande folkhälsoproblem, som det ses i 2\u20124% av termleveranserna och 25\u201230% av prematurleveranserna^8,9.

Chorioamnionitis kan ha betydande effekter på fostret och hos. Det har dokumenterats väl i litteraturen att chorioamnionitis är associerad med ökad risk för många av sjukligheterna av mödraskap, inklusive bronchopulmonary dysplasi^10,cerebral vit fråga^{skada 11,}intraventricular blödning^12,retinopati av prematuritet¹³, och både misstänkt och bekräftade tidigt insjukna neonatal sepsis^14,15. Eftersom vi är intresserade av skade- och reparationsmekanismer i det omogna tarmkanalen är det viktigt att notera att chorioamnionitis också är förknippad med senare utveckling av nekrotiserande enterokolit (NEC)^15,16. NEC är en förödande gastrointestinal sjukdom hos prematura spädbarn som resulterar i ett dysreglerat värdsvar på inflammation och efterföljande tarmnekros¹⁷. Varje år drabbar NEC över 4000 spädbarn i USA, och upp till en tredjedel av dessa spädbarn dör av sjukdomen¹⁸. Patogenesen vid NEC innebär sannolikt en kombination av tarmomognad, dysregulering av det omogna immunsystemet, tarminflammation och bakteriell^{flyttning 19}, vilket kulminerar i en slutlig gemensam väg för tarmnekros. Viktigt är att uppkomsten av NEC ofta inträffar veckor efter födseln och potentiell exponering för chorioamnionitis, vilket gör den mekanistiska länken mellan chorioamnionitis och efterföljande utveckling av NEC oklart²⁰. En potentiell mekanism genom vilken chorioamnionitis kan bidra till pathophysiology av NEC är genom uppreglering av moderns immunsystem, därefter producerar en stark fetala inflammatoriska svar som kan störa normala fetala utvecklingsmönster^21,22,23.

Flera däggdjursmodeller av chorioamnionitis finns hos gnagare och får^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Det finns dock få data om utvecklingen av tarmkanalen efter den första nyfödda perioden efter chorioamnionitis-inducerad fetala exponering för moderns inflammation (FEMI). För att utforska förhållandet mellan FEMI och efterföljande utveckling av skada i det omogna tarmkanalen har vi anpassat lipopolysackarid (LPS)-inducerad FEMI-modell. Lipopolysackarider är en viktig komponent i den extracellulära ytan på gramnegativa bakterier och är ett potent stimulerande medel för det medfödda immunsystemet hos flera eukaryota arter, inklusive människor³³. Moderns LPS injektion resulterar i en steril inflammatorisk kaskad utan förvirrande effekter av levande bakterier, och det är en väletablerad modell för induktion av prematur födsel³⁴, liksom en modell av akut chorioamnionitis och fetala inflammatoriska svar syndrom (FIRS), som är den allvarligaste formen av chorioamnionitis^24,35. Det har också visat sig inducera både cerebral vit och grå materia skada i en får modell³⁶ och en murin modell^37,38,39,40. Men till vår kunskap är vi de första att använda denna modell av chorioamnionitis och FEMI för att undersöka dess effekter på utvecklingen av mag-tarmkanalen tidigare födseln, liksom att undersöka en möjlig mekanistisk länk mellan chorioamnionitis och senare utveckling av NEC^41,42.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av University of Iowa Institutional Animal Care and Use Committee (Protocol #8041401). Alla djur inrymdes i ett association för bedömning och ackreditering av laboratoriedjurvård (AALAC) godkänt vivarium vid University of Iowa. Alla möss var vilda typ stam C57Bl/6J. 1. Etablering av FEMI hos dräktiga möss LPS-förberedelse Använd LPS som härrör från Escherichia coli O55:B5 (stamkoncentration 2 mg/ml). Späd LPS-stamk…

Representative Results

Exponering för FEMI på embryonal dag 15 leder till en dosberoende förlust av graviditet och en dosberoende frekvens av prematurt arbete (figur 1)42. För experimenten valde vi att använda en LPS-dos på 100 μg/kg för att minimera graviditetsförlust och prematuritet (50% förlust mellan både prematuritet och intrauterin fosteravgång) samtidigt som fostret utsattes för en betydande inflammatorisk förolämpning. Med hjälp av detta …

Discussion

Chorioamnionitis påverkar 2\u20124% av löptiden och 25\u201230% av prematur leveranser^8,9. Effekten av chorioamnionitis kan dock förlänga lång efter födseln eftersom det har visat sig ha betydande effekter på fostret och nyfödda^{10,11,12,13,14,15,}<su…

Materials

10% neutral buffered formalin	Sigma	HT501128
Alcian blue stain	Newcomer supply	1003A
C57Bl6/J mice	Jackson Laboratories	664
Ethanol	Decon labs	2701
HCl	Sigma	H1758
Hematoxylin stain	Leica	381562
LPS	Sigma	L2880
NaHCO3	Sigma	S6014
Nikon Eclipse Ni-U Microscope	Nikon	2CE-MQVJ-1
Periodic Acid	ACROS	H5106	CAS# 10450-59-9
RNAlater	Thermofisher	Am7021
Schiff's reagent	Sigma	S5133
Secor Imager 2400	Meso Scale Discovery (MSD)
V-Plex Assay	Meso Scale Discovery (MSD)
Xylene	Sigma	534056