Analyse van human natural killer cell metabolisme
Summary
In dit artikel beschrijven we een methode om glycolyse en mitochondriale ademhaling te meten in primaire menselijke Natural Killer (NK) cellen geïsoleerd van perifeer bloed, in rust of na IL15-geïnduceerde activering. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot primaire menselijke NK-cellen die worden geactiveerd door andere cytokines of oplosbare stimuli.
Abstract
Natural Killer (NK) cellen bemiddelen voornamelijk aangeboren anti-tumor en anti-virale immuunreacties en reageren op een verscheidenheid van cytokinen en andere stimuli ter bevordering van overleving, cellulaire proliferatie, productie van cytokinen zoals interferon gamma (IFNγ) en / of cytotoxiciteit programma’s. NK celactivering door cytokine stimulatie vereist een aanzienlijke remodellering van metabole trajecten ter ondersteuning van hun bio-en bio-synthetische eisen. Er is een grote hoeveelheid bewijs dat suggereert dat verminderde NK celmetabolisme wordt geassocieerd met een aantal chronische ziekten, waaronder obesitas en kanker, die het klinische belang van de beschikbaarheid van een methode om NK celmetabolisme te bepalen benadrukt. Hier beschrijven we het gebruik van een extracellulaire flux analyzer, een platform dat real-time metingen van glycolyse en mitochondriaal zuurstofverbruik mogelijk maakt, als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme van menselijke NK-cellen te monitoren. De hier beschreven methode maakt het ook mogelijk om metabole veranderingen te monitoren na stimulatie van NK-cellen met cytokines zoals IL-15, een systeem dat momenteel wordt onderzocht in een breed scala aan klinische studies.
Introduction
Natural Killer (NK) cellen zijn aangeboren lymfocyten die anti-tumor en anti-virale reacties bemiddelen. NK-cellen bestaan uit 5-15% van alle lymfocyten in menselijk perifeer bloed, en kunnen ook worden gevonden in milt, lever, beenmerg en lymfeklieren. NK-cellen drukken geen polymorfe clonotyp receptoren uit, zoals T-celreceptoren (TCR) of B-celreceptoren (BCR). De activering van hun cytolytische functies daarentegen wordt ingegeven door de betrokkenheid van receptoren die onveranderlijke liganden herkennen op het oppervlak van een doelcel1,2.
Rustende menselijke NK cellen geïsoleerd uit perifeer bloed kan overleven voor meerdere dagen in cultuur medium aangevuld met menselijk serum. Activering van NK-cellen door cytokinen zoals IL-15 of IL-2 drijft de cellen tot proliferatie en tot een toename van hun moordvermogen, onder andere effecten3,4,5. Verschillende studies hebben een directe correlatie aangetoond tussen NK-celactivering en veranderingen in hun metabolische activiteit6. Deze metabolische veranderingen zijn bestemd om te voldoen aan de specifieke eisen van de cellen in termen van energie en biosynthese.
Aërobe cellen en organismen verkrijgen energie door middel van een reeks chemische reacties die de katabolisme en oxidatie van koolhydraten, vet en eiwitten te betrekken. Door een combinatie van glycolyse, de tricarboxylzuurcyclus (TCA) en oxidatieve fosforylatie voldoen eukaryotische cellen aan de meerderheid van hun ATP-vraag en verkrijgen ze tussenproducten die nodig zijn als bouwstenen voor macromolecules die essentieel zijn voor celgroei en proliferatie. Het proces van glycolyse (figuur 1A) begint met de invoer van glucose in de cel. In de cytosol wordt glucose gefossyleerd en omgezet in pyruvaat (met een nettoproductie van 2 moleculen ATP per glucosemolecuul), die kunnen worden gereduceerd tot lactaat of getransporteerd naar de mitochondriën om te worden omgezet in Acetyl-CoA en de TCA-cyclus binnen te gaan. De TCA-cyclus blijft fietsen gevoed met meer moleculen van Acetyl-CoA en produceert CO2 (die uiteindelijk buiten de cel zal verspreiden en, door te reageren met H2O in het medium, zal genereren koolzuur dat zal leiden tot de verzuring van het medium) en NADH, het molecuul belast met het doneren van elektronen aan de elektronentransportketen (ETC). De elektronen reizen door verschillende eiwitcomplexen en worden uiteindelijk geaccepteerd door zuurstof. Deze complexen (I, III en IV) pompen ook H+ van de mitochondriale matrix in de intermembrane ruimte. Als gevolg van de elektrochemische gradiënt gegenereerd, zal de H+ opnieuw in de matrix via de complexe V (ATP-synthase), het investeren van de potentiële energie verzameld in de generatie van ATP.
Zowel glycolyse als mitochondriale ademhaling kunnen op verschillende punten worden geblokkeerd met behulp van remmers. De kennis en het gebruik van deze remmers was de basis voor de ontwikkeling van de extracellulaire fluxtest. Door twee eenvoudige parameters in real time te meten, zoals pH en zuurstof, leidt de extracellulaire flux analyzer de snelheid van glycolyse en mitochondriale ademhaling af in een 96-put plaat. De glycolysestresstest wordt uitgevoerd in een basaal medium zonder glucose (figuur 1B)7. De eerste metingen van de extracellulaire verzuring (ECAR) zijn indicatief voor glycolyse-onafhankelijke verzuring. Het wordt aangeduid als niet-glycolytische verzuring en correleert met CO2 geproduceerd door de TCA die, zoals eerder uitgelegd, combineert met H2O in het medium om H+ (TCA-gekoppelde ECAR) te genereren. De eerste injectie is glucose om glucosegebruik te induceren en glycolyse te stimuleren. De tweede injectie combineert zowel rotenone, een Complexe I-remmer, en antimycine A, een Complexe III-remmer samen, om de ETC. Cellen te blokkeren reageren op deze dramatische afname van mitochondriale ATP-productie door het activeren van glycolyse om cellulaire ATP-niveaus te handhaven, en dit vertegenwoordigt de hoeveelheid glycolyse die niet wordt gebruikt door de cel in de basale toestand, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op de toename van de ATP-vraag (compenserende glycolyse). De derde injectie is de glucose analoge 2-Deoxyglucose (DG), die concurreert met glucose als substraat voor het enzym hexokinase. Het product van deze fosforylatie, 2-deoxyglucose-6-fosfaat kan niet worden omgezet in pyruvaat, en daarom glycolyse wordt geblokkeerd, waardoor de ECAR tot zijn minimum wordt beperkt. De op dit punt gemeten ECAR omvat andere bronnen van extracellulaire verzuring die niet worden toegeschreven aan glycolyse of ademhalingsactiviteit, evenals eventuele resterende glycolyse die niet volledig door 2-DG (post 2-DG-verzuring) wordt geremd.
De mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd in een medium met glucose (figuur 1C)8. De eerste metingen van het zuurstofverbruik (OCR) komen overeen met de basislijn van mitochondriale ademhaling (basale ademhaling). De eerste injectie is oligomycine, die de terugkeer van protonen via de ATP-synthase (complex V) remt, de ATP-synthese blokkeert en zo snel het mitochondriale membraan hyperpolariseert, wat verdere protonpompen door ademhalingscomplexen voorkomt en leidt tot een afname van OCR. De vergelijking tussen de basisinademing en de waarde die wordt gegeven door toevoeging van oligomycine vertegenwoordigt de atp-gekoppelde ademhaling. De resterende oligomycine-ongevoeligheidsgraad van zuurstofverbruik wordt protonlek genoemd, dat de stroom van protonen door de lipidebilayer of eiwitten in het binnenste mitochondriale membraan vertegenwoordigt, zoals de adenine nucleotide translocase9. De tweede injectie is de ontkoppelaar 2,4-dinitrophenol (DNP), een ionofoër die een massale binnenkomst van H+ in de mitochondriale matrix induceert, wat leidt tot depolarisatie van het mitochondriale membraan en verstoring van mitochondriale ATP-synthese. Cellen reageren op de dissipatie van de proton-bewegingskracht door het verhogen van de snelheid van elektronentransport en zuurstofverbruik tot maximale niveaus in een vergeefse poging om membraan potentieel (maximale ademhalingscapaciteit) te herstellen. Het verschil tussen de maximale ademhalingscapaciteit en de basale ademhaling is de reserveademhalingscapaciteit van de cel, die de hoeveelheid ademhaling vertegenwoordigt die niet door de cel wordt gebruikt om ATP in de basale toestand te genereren, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op een toename van de ATP-vraag of onder stressomstandigheden8. De derde injectie is een combinatie van rotenone en antimycine A. Deze injectie stopt volledig de ETC en OCR daalt tot het laagste niveau, met de resterende zuurstofverbruik wordt niet-mitochondriaal (veroorzaakt door NADPH-oxidases, enz.).
Veranderingen in metabole trajecten kunnen op de een of andere manier de werking van NK-cellen voorspellen, omdat is gesuggereerd dat continue activering van NK-cellen met cytokines in vitro kan leiden tot NK-celuitputting door de studie van verschillende metabole trajecten10,11. De correlatie tussen NK cel metabolische status en functie is zeer belangrijk vanuit het oogpunt van kanker immunotherapie. Op dit gebied is de activering van NK-cellen met infusie van IL-15, alleen of in combinatie met monoklonale therapeutische antilichamen getest om het doden van tumorcellen12,13,14te verbeteren . De kennis van de metabolische status van de NK-cellen in reactie op deze behandelingsstrategieën zou een waardevolle voorspeller zijn van de NK-celactiveringsstatus en de moordfunctie.
De studie van metabole trajecten in andere myeloïde en lymfoïde cellen zoals monocyten, T- en B-cellen is beschreven15 en geoptimaliseerde methoden zijn gepubliceerd16. In dit protocol bieden we een methode die zowel een NK isolatieprotocol combineert dat hoge aantallen zuivere en levensvatbare NK-cellen oplevert als een geoptimaliseerd protocol om metabole activiteit te meten met behulp van een extracellulaire flux analyzer. Hier tonen we aan dat dit een geldige methode is voor de studie van metabole veranderingen in rust en IL-15 geactiveerde menselijke NK cellen. Voor de extracellulaire fluxtest zijn parameters zoals celnummer en medicijnconcentraties getest en geoptimaliseerd. Vergeleken met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is volledig geautomatiseerd en in staat om te testen in real time, met zeer lage hoeveelheden cellen, tot 92 monsters tegelijk, en dus maakt hoge doorvoer screenings (met meerdere monsters en repliceert) in een relatief snelle manier17.
Deze methode kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van NK celfunctie door het bestuderen van NK celmetabolisme. Het kan ook worden toegepast op cellen geactiveerd door andere cytokinen, antilichamen of oplosbare stimuli.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit document hebben we een protocol opgesteld voor het efficiënt isoleren en kweken van zuivere en levensvatbare primaire menselijke NK-cellen uit perifeer bloed. We hebben ook de voorwaarden geoptimaliseerd voor de meting van de metabolische activiteit van deze NK cellen beoordeeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring met behulp van een extracellulaire flux analyzer. In vergelijking met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is snel, vereist kleine aantallen cellen, en maakt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) voor steun en discussie. Deze studie werd ondersteund door de intramurale onderzoeksprogramma’s van de National Institutes of Health, National Cancer Institute en National Heart, Lung, and Blood Institute. JT wordt ondersteund door het Ramon y Cajal programma (grant RYC2018-026050-I) van MICINN (Spanje).
Materials
| 2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | MilliporeSigma | D8375-5G | Glycolyisis stress test injector compound |
| 2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP) | MilliporeSigma | D198501 | ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound |
| 96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid | Costar | 3799 | NK cell culture |
| Antimycin A | MilliporeSigma | A8674 | Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| BD FACSDIVA Software | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| BD LSR Fortessa | BD Biosciences | Flow data acquisition | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive |
| CyQUANT cell proliferation assay | ThermoFisher Scientific | C7026 | Cell proliferation Assay for DNA quantification. Contains cell-lysis buffer and CyQUANT GR dye |
| EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II | Stemcell technologies | 17851 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Human NK cell Enrichment Kit | Stemcell technologies | 19055 | NK cell isolation from PBMCs |
| EasySep Magnet | Stemcell technologies | 18001 | NK cell isolation from PBMCs |
| EDTA 0.5 M, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | NK sell separation buffer |
| FACS tubes | Falcon-Fisher Scientific | 352235 | Flow cytometry experiment |
| Falcon 50 ml Conical tubes | Falcon-Fisher Scientific | 14-432-22 | NK cell separation |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Gibco | 10437-028 | NK cell separation buffer |
| FlowJo Software | BD Biosciences | Flow data analysis | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270 | Component of mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound |
| Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Protease inhibitor 100X. Use in RIPA lysis buffer |
| Human IL-15 | Peprotech | 200-15-50ug | NK cell stimulation |
| Human serum (HS) | Valley Biomedical | 9C0539 | NK cell culture medium supplement |
| IMDM | Gibco | 12440053 | NK cell culture medium |
| L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | Component of stress test media |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34965 | Viability dye for flow cytometry staining |
| LSM | mpbio | 50494X | PBMCs separation from human blood |
| Mouse anti-human CD3 BV711 | BD Biosciences | 563725 | T cell flow cytometry staining |
| Mouse anti-human CD56 PE | BD Pharmingen | 555516 | NK flow cytometry staining |
| Mouse anti-human NKp46 PE | BD Pharmingen | 557991 | NK flow cytometry staining |
| Oligomycin | MilliporeSigma | 75351 | Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound |
| PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | NK cell separation buffer |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | For determination of protein concentration |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | Cell lysis |
| Rotenone | MilliporeSigma | R8875 | Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound |
| Seahorse Wave Controller Software | Agilent | Controller for the Seahorse XFe96 Analyzer | |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent | For data analysis | |
| Seahorse XF Base Medium | Agilent | 102353-100 | Extracellular Flux assay base medium |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Extracellular Flux Analyzer | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | Includes 20 XF96 cell culture plates, 18 XFe96 sensor cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and 1 bottle of calibrant solution (500 ml). |
| Sodium bicarbonate | MilliporeSigma | S5761 | To prepare the Cell-Tak solution |
| Sodium pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360-070 | Component of mitochondrial stress test medium |
Referências
- Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition. Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).
- Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
- Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors. Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).
- Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. Interleukin-2 augments natural killer cell activity. Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).
- Anton, O. M., et al. Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).
- Marcais, A., et al. The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells. Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).
- Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements. PloS One. 11 (3), 0152016 (2016).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).
- Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment. Frontiers in Immunology. 10, 2278 (2019).
- Felices, M., et al. Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219 (2018).
- Miller, J. S., et al. A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors. Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).
- Conlon, K. C., et al. IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion. Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).
- Dubois, S., et al. IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities. Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).
- Traba, J., et al. Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. (117), e54918 (2016).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. Journal of Visualized Experiments. (116), e54615 (2016).
- Theorell, J., Bryceson, Y. T. Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).
- Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements. Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).
- O’Brien, K. L., Finlay, D. K. Immunometabolism and natural killer cell responses. Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).
- Ahn, B. H., et al. A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).
- Stram, A. R., Payne, R. M. Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).
- Armstrong, J. A., et al. Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift. Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
- Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate. Journal of Visualized Experiments. (106), e53464 (2015).
- Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).
- Michelet, X., et al. Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses. Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).
