从Sézary综合征患者中分离人外周血单核细胞和CD4 + T细胞以进行转录组学分析

Summary

我们提出了一种简单的方案，用于从诊断为Sézary综合征的患者获得的全血中分离外周血单核细胞，然后选择CD4 + T细胞，用phorbol12-肉豆蔻酸酯13-乙酸盐和A23187离子载体刺激它们，并制备RNA进行转录组学分析。

Abstract

皮肤 T 细胞淋巴瘤 （CTCL） 来源于成熟皮肤归巢 T 细胞的转化和不受控制的增殖，蕈样肉芽肿 （MF） 和 Sézary 综合征 （SS） 是最常见的亚型。尽管对CTCL的基因表达，遗传改变和表观遗传异常进行了许多研究，但MF / SS的分子发病机制尚不清楚。MF 是指以皮肤为主的更常见的 CTCL，通常仅限于皮肤，而 SS 是 CTCL 的侵袭性白血病变异型，具有广泛的皮肤受累，其特征为肿瘤分布，主要累及血液、皮肤和淋巴结。以临床实践为重点，基因表达生物标志物的鉴定在改善MF/SS的诊断和治疗方面具有巨大的潜力。事实上，最近的转录组学研究已经从正常和恶性T细胞之间基因表达的差异中确定了潜在的诊断生物标志物，这可能会提高我们对SS生物学的理解，并揭示潜在的治疗靶点。本手稿描述了一种详细的可重复方案，用于从诊断为 SS 的患者的新鲜全血中分离外周血单核细胞，选择 CD4+ 记忆 T 细胞 （CD4+ CD45RO+ T 细胞），化学刺激以及制备适合转录组学分析的 RNA 以发现新的预后分子标志物，从而进一步了解疾病病因学。使用化学激动剂激活核调控的刺激为动态转录调控和基因表达中重要的途径提供了更具体的评估，并消除了由细胞膜TCR抗原丢失引起的上游信号传导缺陷可能引起的混杂缺陷。通过比较未受刺激的SS T细胞的转录组获得的数据揭示了从静止的未刺激细胞的分析中不明显的功能调节基因表达缺陷。此外，从该方法概述的方法可以适用于研究其他T细胞免疫疾病中的T细胞基因表达缺陷。

Introduction

皮肤 T 细胞淋巴瘤 （CTCL），包括最常见的蕈样肉芽肿 （MF） 和 Sézary 综合征 （SS） 亚型，是一组异质性疾病，来源于成熟皮肤归巢 T 细胞^1，2 的转化和不受控制的增殖。肿瘤性T细胞具有成熟的CD4+ CD45RO+，记忆表型³，并表达皮肤归位粘附标志物，增加表皮病⁴，其表现为皮疹，特别是在疾病早期。在常规管理式治疗下，MF 的临床病程通常是惰性的，但一部分患者可进展为更晚期的疾病。在这些MF病例中，皮肤病变生长并增厚成大肿瘤，肿瘤性T细胞可能播散到淋巴结和内脏器官。相比之下，SS 是 CTCL⁵ 的一种更具侵袭性的白血病变异型，其特征是三联症状：全身性红皮病（定义为影响>总表面积的 80%）、淋巴结肿大，以及存在超过 1000/mm³ 的循环克隆非典型 T 细胞与脑状核，即所谓的 Sézary 细胞^6，7.SS 患者的预后明显差于 MF。SS 罕见，发病率为 0.1/100，000，约占 CTCL 病例^{总数 8，9} 的 3%。CTCL 通常表现在中位年龄约为 60 岁¹⁰ 岁的老年人中。CTCL的发病率一直在上升，虽然病因不明，但自1998年以来，该发病率已稳定下来^11，12。

SS 的分子发病机制尚不清楚。遗传，表观遗传和基因表达研究已经产生了大量新数据，但是仍然存在不一致的发现，主要是由于研究^{的患者队列2}，以及实验设计和对照群体^13，14的差异。改进的基因组和转录组学表征可以阐明疾病机制和以前未开发的治疗靶点。因此，需要来自更大患者群体的更多研究来更好地了解这种异质性恶性肿瘤。在一个SS队列中具有高敏感性和特异性的生物标志物组合在其他队列¹⁵中表现不太均匀，这代表了SS¹⁶的可靠诊断和预后生物标志物开发严重障碍。理想的诊断生物标志物在恶性T细胞中将持续且高度过度表达，而在正常T细胞中不存在或几乎不存在¹⁷。疾病特异性生物标志物的发现对于推进SS的诊断和治疗方案非常重要。

恶性和正常 T 细胞的高质量转录组学数据需要一种高效可靠的样品制备方法。在这里，我们将讨论一种详细而简单的策略，以从与SS相关的T细胞群中获取RNA样品。我们将讨论从全血中分离外周血单核细胞（PBMC），疾病相关CD4 + CD45RO + T细胞群的负磁性选择，揭示功能反应差异的化学活化以及RNA的制备以进行转录组学分析。在目前的方案中，已经使用磷酸肉豆蔻酸酯醋酸酯（PMA）和钙离子载体（A23187）^18，19进行了化学活化，因为先前的研究表明CTCL中的T细胞受体信号传导有缺陷，并且PMA / A23187的刺激绕过了T细胞受体^20，21。此外，PMA / A23187允许更直接地近端激活细胞因子基因激活所需的核信号。最后，对T细胞的刺激为基因表达的调节提供了额外的洞察力，而这在没有动态变化的情况下无法从静息的T细胞中获得。

Protocol

人类细胞具有潜在的传染性。因此，实验严格按照职业安全与健康管理局（OSHA）和个人防护设备（PPE）讨论的必要预防措施和程序进行。 1. 从全血中分离多溴联苯 从 表1 中收集所需的所有材料，并将它们带到室温（RT）。将RP10F加热至37°C。 将离心机调节至室温。除离心和细胞计数外，使用生物安全柜中的活细胞执行所有步骤。 在五个含有抗凝剂的10mL管（所需量）中获取血液。将全血储存在环境温度 （18\u201224 °C） 下。在 50 mL 分离管上标有待处理血液样本的人类研究受试者编号。 将 10\u201215 mL 血液输送到每个具有匹配受试者编号的分离管中。用汉克的平衡盐溶液（HBSS）稀释血液至少2倍。每根管不要超过35毫升稀释的血液。 小心地，慢慢地用〜13 mL密度培养基覆盖血液。观察管底部的透明密度介质，并在移液器几乎空时停止移液（以防止气泡释放）。小心取出移液器，以避免混合血液和密度介质层。 小心地将填充的分离管转移到离心机中，而不会干扰层。 在离心机制动器关闭的情况下以500× g 离心30分钟（减速设置为零）。注：如果离心机仅显示转速，请查阅转子规格以估算 500 x g 的转速当量。 小心地从离心机中取出分离管，而不会干扰层。观察在密度介质和等离子体层之间形成的黄褐色涂层。 从顶部移液以除去并丢弃大部分上部血浆部分，以便10 mL保留在buffy涂层上方。小心而缓慢地收集浅黄色的外套。将两个分离管中的buffy涂层转移到新的预标记和无菌的50mL管中，如图 1所示。 用HBSS稀释PBMC至少2倍，使每个新管中的体积达到50 mL。请记住将离心机制动器完全关闭。通过以400× g 离心10分钟沉淀PBMC。尽可能多地除去上清液，然后点击管的底部以松开沉淀。 为了裂解残留的红细胞 （RBC），每 10 mL 原始血容量将每个细胞沉淀重悬于 1\u20122 mL 氯化铵钾 （ACK） 裂解缓冲液中。孵育5分钟。立即停止使用等体积或更大体积的 HBSS 裂解，并将体积调节至 50 mL。以400× g 离心10分钟。 取出上清液并轻敲管底部以松开细胞沉淀。池化来自同一供体的细胞。使用 HBSS 使容量达到 50 mL。以400× g 离心10分钟。 取出上清液并轻敲管底部以松开细胞沉淀。将细胞重悬于10mL温热的RP10F培养基中，并使用台盼蓝取等分试样进行活细胞计数。 使用血细胞计数器计算每个样品中的总细胞数。 2. 从多溴联苯中纯化CD4+CD45RO+T细胞 注意：从PBMCs中纯化CD4 + CD45RO + T细胞是通过使用市售的磁分离（参见 材料表）进行的，并进行微小的修改。最好按照试剂盒手册了解孵育时间，因为每个商业试剂盒都有自己的说明。 在10 mL选择缓冲液中洗涤所需量的PBMC。以400× g 离心10分钟。取出上清液并轻敲管底以松开沉淀。 在选择缓冲液中将PBMCs稀释至5 x 107 细胞/ mL，并将其转移到5 mL聚苯乙烯圆底管（12 x 75 mm）中。 每 1 mL 样品加入 50 μL 抗体混合物，轻轻混合。在室温下孵育5分钟。 使用前，立即以高速涡旋磁性颗粒30秒。将每1 mL样品中加入50μL磁性颗粒到含有PBMC的管中，并轻轻混合。 使用选择缓冲液将体积调至 2.5 mL，然后轻轻混合。将管（不带盖）放入磁铁中，并在室温下孵育2.5分钟。 拿起磁铁，在连续的运动中，反转磁铁和管子，将富集的细胞悬浮液倒入新的无菌管中。 为了增加恢复率，向留在磁体中的管中加入2.5 mL选择缓冲液，而不会干扰固定的磁珠。在磁铁中再保持2.5分钟，然后重复步骤2.6以恢复其他细胞。 服用等分试样，使用台盼蓝进行活细胞计数。使用血细胞计数器或细胞计数器计算总细胞数。 通过流式细胞术确认纯度（图3）。 3. 化学活化 用温热的RP10F培养基将CD4 + CD45RO + T细胞调节至5 x 106 细胞/ mL，并将细胞分配到所需大小的培养皿中。将细胞在加湿的37°C 5%CO2 培养箱中静置过夜。 通过以400× g 离心10分钟沉淀静置的细胞。取出上清液并轻敲管底部以松开细胞沉淀。 用温热的 RP10F 培养基将细胞浓度调节至 5 x 106 个细胞/mL，并将 0.5\u20121 x 107 个细胞分布到三个无菌螺旋盖管中。注意：如果有足够的细胞可用，实验设计中可能包括重复的刺激或其他时间点。 用PMA和A23187刺激管2和3中的细胞。将 PMA 加入 25 ng/mL，将 A23187 加入 500 ng/mL，轻轻混合。向管1中的细胞中加入等体积的二甲基亚砜（DMSO），该管将用作载体（对照）。例如，如果使用1μLPMA和1μL A23187，则向车管中加入2μL DMSO。在所有试管中将DMSO的最终浓度保持在0.5%以下。 松开试管上的盖子，并将细胞返回到37°C 5%CO2 培养箱2小时（试管2）和6小时（试管1和3）。在指示的时间，以500× g 离心细胞10分钟。 在裂解之前，尽可能多地丢弃上清液，而不干扰细胞沉淀。 按照市售RNA分离试剂盒的说明迅速裂解细胞（参见 材料表）。继续进行RNA分离，或在-80°C下冷冻裂解物，以便稍后使用其他样品进行处理。注意：RNA纯度和完整性可以使用微毛细管电泳进行验证。 可选：要从纯化的RNA样品中完全去除所有痕量DNA，请根据制造商的说明使用RNA纯化试剂盒（参见 材料表）。

Representative Results

该协议包括从SS血液中分离PBMC，通过阴性选择纯化CD4 + CD45RO + T细胞，刺激纯化的T细胞以及分离总RNA以进行转录组学分析的程序。 图1 描述了从全血中分离PBMC的过程。请注意，SS PBMC的总产量将随每位患者的起始血容量和循环肿瘤负担而变化。在我们的实验室中，SS PBMC的平均产量为4.6×106 个细胞/ mL全血（1.85×106 – 3.25 x 107 个细胞/ mL的7个SS）。分离的 PBMC 的平均生存率为 95\u201299%。 图2 显示了所选CD4 + CD45RO +记忆T细胞的高纯度和活力。来自SS PBMC的CD4 + CD45RO + T细胞的平均产量为75%（75.6%–84%），而从白细胞减少系统（LRS）室获得的正常供体（ND）PBMC的CD4 + CD45RO + T细胞的平均产量为15.9%（3%–30%）。通过这种负选择方案获得的CD4 + CD45RO + T细胞的活力和纯度一直很高（图3）。 我们之前将上述激活方案与微阵列相结合，研究了SS和ND T细胞转录组的功能变化，并证明与ND T细胞和PBMCs相比，SS记忆T细胞和SS PBMC表达细胞因子和其他免疫反应基因较差19，22，23。图4显示了ND T细胞中包括IL4，IL 10，IL13和IL22在内的几种细胞因子基因的稳健激活，但在SS T细胞中则没有。 SS T细胞中功能基因表达的这种缺陷已被其他组24证实。此外，许多通常在ND T细胞中表达的基因在SS T细胞中高度表达，无论是在休息时还是在刺激后（图4）。这些包括先前描述的SS生物标志物基因DNM3，PLS3，TOX和TWIST125，26，27，以及ANK1和SGCE，这些基因由我们小组首次报道。这些阳性生物标志物在SS中高度表达，但不是ND，并避免了与阴性生物标志物相关的技术陷阱。 图1：从全血中分离出PBMC。请点击此处查看此图的大图。 图2：从分离的PBMC中负选择CD4 +存储T细胞。请点击此处查看此图的大图。 图3：通过流式细胞术确认CD4 + CD45RO + T细胞的纯度。 淋巴细胞通过光散射（A）进行门控，活淋巴细胞排除eFluor780活性染料（B），（C）代表非选定的正常供体（ND）。阴性选择导致ND（D）和SS患者（E）中CD45RO + T细胞的几乎纯群体。 请点击此处查看此图的大图。 图4：来自SS和ND的静息和活化的CD4 + CD45RO +记忆T细胞中的差异基因表达。 基因表达z评分由从红色（高表达）到绿色（低表达）的色阶表示。热图顶部的彩色条表示细胞处理：模拟/车辆处理（红色），2小时刺激（蓝色）和6小时刺激（黄色）。与ND T细胞相比，几种SS生物标志物基因高度表达，细胞因子基因在SS T细胞中的表达不良。 请点击此处查看此图的大图。 试剂 密度 介质 淋巴细胞分离培养基，Ficoll-Hypaque或等效密度培养基，密度= 1.077-1.080g / ml在20°C时。 哈佛商学院 1x Hank’s 平衡盐溶液，4.2 mM NaHCO3，10 mM HEPES，pH 7.2 RP10F RPMI 1640 培养基，10 % 热灭活胎牛血清 （FBS），1x 青霉素-链霉素溶液，pH 7.2 ACK 裂解缓冲液 155 mM NH4Cl， 10 mM KHCO3， 0.1 mM Na2EDTA， 无需调整pH值。它应该是~7.3。 选择缓冲区 1x 哈佛商学院， 2% FBS， 2 mM EDTA 佛波bol12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯 50 微克/毫升 DMSO 溶液 A23187 离子载体 500 微克/毫升 DMSO 溶液 表1：试剂。

Discussion

已经开发出几种隔离PBMC的方法，每种方法都有自己的优点和局限性²⁸.我们通常将多达 50 mL 血液收集在五个含有抗凝剂的 10 mL 管中。用于PBMC分离的血液量取决于几个因素，例如研究对象的健康和年龄以及抽血师的专业知识。协议中的关键程序步骤是步梯度的形成。分层不良可能导致PBMC部分或完全失效，以沉淀在界面处。我们更喜欢这里描述的底层方法，因为它很容易启动底层。为了完全分配血液下方的所有密度培养基，使用无空气泄漏的移液器辅助器至关重要。通过仔细和一致地收集白细胞层，可以最大限度地减少不需要的细胞类型对PBMC组分的污染，对于每次分离，应以相同的方式进行。如果PBMC不会进一步分馏，则应避免在隔离之间收集不同量的密度梯度和等离子体层。进行红细胞裂解以最大限度地减少污染红细胞和网织红细胞衍生RNA对下游基因表达分析的潜在影响。低渗溶解会被过量的等渗缓冲液抑制。

进一步分离T细胞亚群对于分子研究很重要。在这里，我们描述了随后的CD4 + CD45RO + T细胞选择，通过负选择来去除不需要的细胞类型。阴性选择依赖于抗体识别所有不需要细胞的特定细胞表面标志物。然后用磁珠除去抗体包被的细胞。该选择方案去除不需要的细胞，同时允许未触及和未受刺激的靶细胞保持自由漂浮，这对于研究基因激活至关重要。然而，必须注意避免细胞团块，这会降低所选CD4 + CD45RO + T细胞的最终纯度。选择缓冲液中存在的乙二胺四乙酸（EDTA）可最大限度地减少细胞聚集。T细胞的产量取决于诸如初始血液体积，患者变量（例如向患者施用的治疗）和样本收集时的疾病阶段等因素。给予患者的治疗也可能影响细胞活力。此外，在任何程序（如光分离置换）之前收集样品也对CD4 + CD45RO + T细胞纯度有积极影响。我们观察到光分离处理程序后的样品收集对CD4 + CD45RO + T细胞的产量有负面影响。

来自SS患者的肿瘤性T细胞克隆最常表达与成熟记忆CD4 T细胞表型^29，30一致的表面标志物。然而，偶尔观察到表型可塑性，包括CD4，CD45RO，CD45RA，CD7和/或CD26³¹。先前的研究还表明，²⁹ 名 SS 患者中 CD45RO 和 CD45RA 表达存在异质性，而大多数 SS 病例仍为 CD45RO+。Roelens等人³¹ 还表明，SS可能表现出个体间和个体间异质性，具有幼稚（TN），中央记忆（TCM），过渡记忆（TTM），效应器记忆（TEM）和终末效应子记忆（TEMRA）亚群的混合群体。然而，他们的研究结果清楚地表明，大多数SS细胞具有中医表型。我们将研究重点放在SS患者中最常见的CD45RO +表面免疫表型上，并通过流式细胞术确认表型。在规划患者T细胞亚群的研究时，重要的是要考虑所研究疾病的表型异质性，因此可以根据需要调整纯化策略以获得所需的T细胞群进行分析。

有几种方法可以刺激T细胞和PBMCs检查功能基因表达。我们更喜欢化学活化（PMA + A23187离子载体），因为我们对细胞核中的基因调控感兴趣。化学活化是实现此目的的最佳选择，因为它充当广泛的活化剂，并且与抗原特异性刺激相比更均匀。PMA是一种小的有机化合物，通过细胞膜扩散到细胞质中，并直接激活蛋白激酶C.A23187允许钙通过膜。这些化合物绕过表面受体，并与CD28介导的共刺激一起模仿T细胞受体连接的作用。这些化学物质激活了几种细胞内信号通路，导致核转录因子激活和细胞因子基因的上调，这些基因可用于转录激活。虽然化学活化和CD3CD28连接在正常细胞³²中产生惊人的相似全局基因表达谱，但PMA + A23187的化学活化是一个不错的选择，因为SS T细胞可以失去表面受体的表达，包括TCR成分³³。Chong等人.²² 比较了PMA / A23187与正常，早期MF / CTCL和晚期MF / CTCL患者的PBMCs中的抗CD3和抗CD28抗体之间的细胞因子基因激活。他们报告说，与抗CD3 / CD28刺激相比，PMA / A23187引起IL-2基因的更快和更强烈的激活。此外，他们表明，抗CD3 / CD28抗体的较慢的激活动力学可能来自刺激所必需的交联和膜信号传导。此外，PMA / A23187保留了所研究的不同细胞群中细胞因子表达的趋势。由于我们对基因表达激活感兴趣，化学刺激是一种理想的方法，因为它具有广泛的激活剂，并且与抗原特异性刺激相比更加一致。CD3/CD28 连接是研究基于膜的信号转导中重要通路的理想选择。此外，化学活化成本较低，不需要特殊设备。在目前的研究中，PMA + A23187在ND中显着激活了细胞因子基因，而不是SS T细胞，这表明SS T细胞在TCR下游具有功能缺陷。

综上所述，该方案提供了来自珍贵患者来源血液的表型纯T细胞，以及评估功能基因表达的全基因组变化的方法。我们证明，与正常CD45RO + T细胞相比，SS T细胞的转录组学分析揭示了CTCL患者新鲜人T细胞中基因激活的深刻差异。这些研究将有助于开发针对CTCL中新标志物的诊断生物标志物和治疗策略。此外，研究原代人类T细胞的这种策略和方案对于适应其他T细胞介导疾病的研究可能很有价值。

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
10 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170356
1000 ul Pipet tips	VWR	10017-038
15 ml Conical Tubes	Corning	352196
25 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170357
5 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170355
50 ml Conical Tubes	Thermo Scientific	339652
A23187 ionophore	Fisher Scientific	BP595
Centrifuge	Thermo Scientific	75004381
DMSO	Sigma	D2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit	StemCell	19157
FBS	GIBCO	16140-071
HBSS	GIBCO	14185-052
HEPES	Fisher Bioreagents	BP310-500
KHCO3	Fisher Bioreagents	P184-500
Lymphocyte Separation Medium	Corning	25-072-CV
Na2EDTA	ACROS	10378-23-1
NaHCO3	Fisher Bioreagents	S233-500
NH4Cl	Fisher Bioreagents	A661-500
Penicillin-streptomycin solution	GIBCO	15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA)	Sigma	P-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	RAININ	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	RAININ	17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	RAININ	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	RAININ	17014392
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1013
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136
RPMI 1640	GIBCO	31800-022
T-25 Flask	Thermo Scientific	2024-10