हम सेज़री सिंड्रोम के निदान वाले रोगियों से प्राप्त पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, इसके बाद सीडी 4 + टी कोशिकाओं का चयन, फोरबोल 12-myristate13-एसीटेट और A23187 आयनोफोर के साथ उनकी उत्तेजना, और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए आरएनए की तैयारी।
त्वचीय टी-सेल लिंफोमा (सीटीसीएल) परिपक्व त्वचा-होमिंग टी कोशिकाओं के परिवर्तन और अनियंत्रित प्रसार से प्राप्त होते हैं, और माइकोसिस फंगोइड्स (एमएफ) और सेज़री सिंड्रोम (एसएस) सबसे आम उपप्रकारों का प्रतिनिधित्व करते हैं। सीटीसीएल के जीन अभिव्यक्ति, आनुवंशिक परिवर्तन, और एपिजेनेटिक असामान्यताओं की विशेषता पर कई अध्ययनों के बावजूद, एमएफ / एसएस के आणविक रोगजनन अस्पष्ट बने हुए हैं। एमएफ एक त्वचा-प्रबलता के साथ अधिक सामान्य सीटीसीएल को संदर्भित करता है, और आमतौर पर त्वचा तक सीमित होता है, जबकि एसएस व्यापक त्वचा की भागीदारी के साथ सीटीसीएल का एक आक्रामक ल्यूकेमिया वाला संस्करण है और मुख्य रूप से रक्त, त्वचा और लिम्फ नोड को शामिल करने वाले नियोप्लास्टिक वितरण की विशेषता है। नैदानिक अभ्यास पर ध्यान केंद्रित करते हुए, जीन अभिव्यक्ति बायोमार्कर की पहचान में एमएफ / एसएस के निदान और उपचार में सुधार करने की भारी क्षमता है। दरअसल, हाल के ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययनों ने सामान्य और घातक टी कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति में अंतर से संभावित नैदानिक बायोमार्कर की पहचान की है, जो एसएस जीव विज्ञान की हमारी समझ में सुधार कर सकता है, और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों को प्रकट कर सकता है। यह पांडुलिपि एसएस के साथ निदान किए गए रोगियों से ताजा पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत पुनरुत्पादक प्रोटोकॉल का वर्णन करती है, सीडी 4 + मेमोरी टी कोशिकाओं (सीडी 4 + सीडी 45आरओ + टी कोशिकाओं) का चयन, रासायनिक उत्तेजना, और रोग एटियलजि में अतिरिक्त अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए उपन्यास भविष्यवाणी आणविक मार्करों की खोज करने के लिए ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए उपयुक्त आरएनए की तैयारी। परमाणु विनियमन को सक्रिय करने के लिए रासायनिक एगोनिस्ट का उपयोग करने वाली उत्तेजना गतिशील प्रतिलेखन विनियमन और जीन अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण मार्गों के लिए अधिक विशिष्ट मूल्यांकन प्रदान करती है और कोशिका झिल्ली पर टीसीआर एंटीजन हानि से उत्पन्न होने वाले अपस्ट्रीम सिग्नलिंग दोषों से उत्पन्न होने वाले भ्रमित दोषों को समाप्त करती है। उत्तेजित एसएस टी कोशिकाओं के लिए unstimulated के ट्रांसक्रिप्टोम की तुलना से प्राप्त डेटा कार्यात्मक नियामक जीन अभिव्यक्ति दोषों unmasks quiescent unstimulated कोशिकाओं के विश्लेषण से स्पष्ट नहीं है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण से उल्लिखित विधि को अन्य टी सेल प्रतिरक्षा रोगों में टी सेल जीन अभिव्यक्ति दोषों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
त्वचीय टी-सेल लिंफोमा (सीटीसीएल), जिसमें सबसे आम उपप्रकार शामिल हैं माइकोसिस फंगोइड्स (एमएफ) और सेज़री सिंड्रोम (एसएस), परिपक्व त्वचा-होमिंग टी कोशिकाओंके परिवर्तन और अनियंत्रित प्रसार से प्राप्त बीमारियों का एक विषम समूह है। नियोप्लास्टिक टी कोशिकाओं में एक परिपक्व सीडी 4 + सीडी 45आरओ + , मेमोरी फेनोटाइप3, और व्यक्त त्वचा होमिंग आसंजन मार्कर होते हैं, जिससे एपिडर्मोट्रोपिज्म4 बढ़ जाता है, जो विशेष रूप से प्रारंभिक बीमारी में दाने के रूप में प्रकट होता है। एमएफ का नैदानिक पाठ्यक्रम अक्सर नियमित रूप से प्रबंधित देखभाल के तहत होने पर उदासीन होता है, लेकिन रोगियों का एक सबसेट अधिक उन्नत बीमारी में प्रगति कर सकता है। इन एमएफ मामलों में, त्वचा के घाव बड़े ट्यूमर में बढ़ते और मोटे हो जाते हैं, और नियोप्लास्टिक टी कोशिकाएं लिम्फ नोड्स और आंत के अंगों में फैल सकती हैं। इसके विपरीत, एसएस सीटीसीएल 5 का एक अधिक आक्रामक, ल्यूकेमिया वाला संस्करण है, जोलक्षणों के त्रिकोण की विशेषता है: सामान्यीकृत एरिथ्रोडर्मा (कुल शरीर की सतह क्षेत्र के >80%) को प्रभावित करने के रूप में परिभाषित), लिम्फैडेनोपैथी, और 1000 / मिमी से अधिककी उपस्थिति 3 सेरेब्रिफॉर्म नाभिक के साथ क्लोनल एटिपिकल टी कोशिकाओं को प्रसारित करना, जिसे सेज़री कोशिकाएं 6,7 कहा जाता है . एसएस रोगियों के लिए पूर्वानुमान एमएफ की तुलना में काफी खराब है। एसएस 0.1/100,000 की घटना दर के साथ दुर्लभ है, और कुल सीटीसीएल मामलों के लगभग 3% का प्रतिनिधित्व करताहै 8,9। सीटीसीएल आमतौर पर पुराने वयस्कों में लगभग 60 वर्ष10 की औसत आयु के साथ प्रस्तुत करता है। सीटीसीएल के लिए घटना दर बढ़ रही थी और जबकि कारण स्पष्ट नहीं है, दर 1998 के बाद से स्थिर हो गई है11,12।
एसएस का आणविक रोगजनन अस्पष्ट रहता है। आनुवांशिक, एपिजेनेटिक और जीन अभिव्यक्ति अध्ययनों ने उपन्यास डेटा का एक खजाना पैदा किया है, हालांकि असंगत निष्कर्ष बने हुए हैं, मुख्य रूप से अध्ययन किए गए छोटे रोगी साथियोंके कारण 2, साथ ही प्रयोगात्मक डिजाइन और नियंत्रण आबादीमें अंतर 13,14। बेहतर जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक लक्षण वर्णन दोनों रोग तंत्र और पहले से अज्ञात चिकित्सीय लक्ष्यों पर प्रकाश डाल सकता है। इसलिए, इस विषम दुर्दमता को बेहतर ढंग से समझने के लिए एक बड़ी रोगी आबादी से अधिक अध्ययन की आवश्यकता है। बायोमार्कर पैनल जो एक एसएस कोहोर्ट में अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट हैं, ने अन्य साथियों15 में कम समान रूप से प्रदर्शन किया है, जो एसएस16 के लिए विश्वसनीय नैदानिक और भविष्यवाणी बायोमार्कर के विकास में एक गंभीर बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। आदर्श नैदानिक बायोमार्कर लगातार और अत्यधिक घातक टी कोशिकाओं में व्यक्त किए जाएंगे, जबकि सामान्य टी कोशिकाओं में अनुपस्थित या लगभग अनुपस्थितहोंगे। रोग-विशिष्ट बायोमार्कर की खोज एसएस के लिए नैदानिक और चिकित्सीय प्रोटोकॉल की प्रगति के लिए महत्वपूर्ण है।
घातक और सामान्य टी कोशिकाओं दोनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा को नमूना तैयारी के लिए एक कुशल और विश्वसनीय दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। यहां, हम एसएस के लिए प्रासंगिक टी सेल आबादी से आरएनए नमूने प्राप्त करने के लिए एक विस्तृत अभी तक सरल रणनीति पर चर्चा करेंगे। हम पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (PBMC) के अलगाव, रोग-प्रासंगिक CD4 + CD45RO + T सेल आबादी के नकारात्मक चुंबकीय चयन, कार्यात्मक प्रतिक्रियाओं में अंतर को प्रकट करने के लिए रासायनिक सक्रियण, और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए आरएनए की तैयारी पर चर्चा करेंगे। वर्तमान प्रोटोकॉल में, रासायनिक सक्रियण को फोरबोल मिरिस्टेट एसीटेट (पीएमए) और कैल्शियम आयनोफोर (ए 23187) 18,19 का उपयोग करके किया गया है, क्योंकि पिछले अध्ययनों ने सीटीसीएल में दोषपूर्ण टी-सेल रिसेप्टर सिग्नलिंग दिखाया है, और पीएमए / ए 23187 के साथ उत्तेजना टी-सेल रिसेप्टर20,21 को बाईपास करती है। इसके अलावा, पीएमए / ए 23187 साइटोकाइन जीन सक्रियण के लिए आवश्यक परमाणु संकेतों के अधिक प्रत्यक्ष समीपस्थ सक्रियण की अनुमति देता है। अंत में, टी कोशिकाओं की उत्तेजना जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में अंतर्दृष्टि का एक अतिरिक्त स्तर प्रदान करती है जिसे टी कोशिकाओं को आराम करने से प्राप्त नहीं किया जा सकता है जहां गतिशील परिवर्तन अनुपस्थित है।
PBMCs को अलग करने के कई तरीके विकसित किए गए हैं, और प्रत्येक के अपने फायदे और सीमाएंहैं। हम नियमित रूप से एंटीकोआगुलेंट युक्त पांच 10 मिलीलीटर ट्यूबों में 50 मिलीलीटर तक रक्त एकत्र करते हैं। PBMC अलगाव के लिए रक्त की मात्रा कई कारकों पर निर्भर करती है जैसे स्वास्थ्य और अनुसंधान विषय की उम्र और फ्लेबोटोमिस्ट विशेषज्ञता पर भी। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण प्रक्रियात्मक चरण चरण ढाल का गठन है। खराब लेयरिंग के परिणामस्वरूप इंटरफ़ेस पर तलछट के लिए PBMCs की आंशिक या पूर्ण विफलता हो सकती है। हम यहां वर्णित अंडर-लेयरिंग विधि को पसंद करते हैं, क्योंकि नीचे की परत शुरू करना आसान है। रक्त के नीचे सभी घनत्व माध्यम को पूरी तरह से वितरित करने के लिए, बिना किसी हवा के रिसाव के साथ एक पिपेट सहायता का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। अवांछित सेल प्रकारों द्वारा PBMC अंश के संदूषण को बफी कोट के सावधानीपूर्वक और सुसंगत संग्रह द्वारा कम किया जा सकता है, जिसे प्रत्येक अलगाव के लिए उसी तरह से किया जाना चाहिए। यदि PBMCs को आगे fractionated नहीं किया जाएगा, तो अलगाव के बीच घनत्व ढाल और प्लाज्मा परतों की विभिन्न मात्राओं को इकट्ठा करने से बचा जाना चाहिए। आरबीसी लाइसिस को डाउनस्ट्रीम जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण पर आरबीसी- और रेटिकुलोसाइट-व्युत्पन्न आरएनए को दूषित करने के संभावित प्रभाव को कम करने के लिए किया जाता है। हाइपोटोनिक लाइसिस को अतिरिक्त आइसोटोनिक बफर द्वारा बाधित किया जाएगा।
टी सेल सबसेट का आगे अलगाव आणविक अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है। यहां हमने अवांछित सेल प्रकारों को हटाने के लिए नकारात्मक चयन द्वारा बाद के CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं के चयन का वर्णन किया है। नकारात्मक चयन सभी अवांछित कोशिकाओं के लिए विशिष्ट सेल सतह मार्करों को पहचानने वाले एंटीबॉडी पर निर्भर करता है। एंटीबॉडी लेपित कोशिकाओं को तब चुंबकीय मोतियों द्वारा हटा दिया जाता है। यह चयन प्रोटोकॉल अवांछित कोशिकाओं को हटा देता है, जबकि अछूते और अउत्तेजित लक्ष्य कोशिकाओं को मुक्त फ्लोटिंग रहने की अनुमति देता है, जो जीन सक्रियण का अध्ययन करने में आवश्यक है। हालांकि, सेल clumps से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जो चयनित CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं की अंतिम शुद्धता को कम करता है। चयन बफर में मौजूद Ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) सेल clumping को कम करता है। टी कोशिकाओं की उपज रक्त की प्रारंभिक मात्रा, रोगी चर जैसे कि रोगी को प्रशासित किए जा रहे उपचार और नमूना संग्रह के समय रोग चरण जैसे कारकों पर निर्भर करती है। रोगियों को दिए गए उपचार से कोशिका व्यवहार्यता भी प्रभावित हो सकती है। इसके अलावा, फोटोफेरेसिस जैसी किसी भी प्रक्रिया से पहले नमूना संग्रह का CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं की शुद्धता पर भी सकारात्मक प्रभाव पड़ता है। हमने देखा है कि फोटोफेरेसिस उपचार प्रक्रिया के बाद नमूना संग्रह का CD4 + CD45RO + T कोशिकाओं की उपज पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है।
एसएस रोगियों से नियोप्लास्टिक टी सेल क्लोन अक्सर एक परिपक्व, मेमोरी सीडी 4 टी सेल फेनोटाइप29,30 के अनुरूप सतह मार्करों को व्यक्त करते हैं। तथापि, कभी-कभी सीडी 4, सीडी45आरओ, सीडी45आरए, सीडी 7 और/या सीडी2631 सहित सतह मार्करों के संबंध में फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी देखी गई है। पिछले अध्ययनों ने एसएस रोगियोंके बीच CD45RO और CD45RA अभिव्यक्ति में विषमता को भी दिखाया है, जबकि अधिकांश एसएस मामले अभी भी CD45RO + हैं। Roelens et al.31 ने यह भी दिखाया कि एसएस भोले (टीएन), केंद्रीय स्मृति (टीसीएम), संक्रमणकालीन स्मृति (टीटीएम), प्रभावक स्मृति (टीईएम), और टर्मिनल प्रभावक स्मृति (टीईएमआरए) सबसेट की मिश्रित आबादी के साथ अंतर-व्यक्तिगत और इंट्राइंडिविजुअल विषमता प्रदर्शित कर सकता है। हालांकि, उनके परिणाम स्पष्ट रूप से दिखाते हैं कि अधिकांश एसएस कोशिकाओं में टीसीएम फेनोटाइप होता है। हमने अपने अध्ययन को एसएस रोगियों में सबसे आम CD45RO + सतह इम्यूनोफेनोटाइप पर केंद्रित किया, और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा फेनोटाइप की पुष्टि की। रोगियों में टी सेल सबसेट के अध्ययन की योजना बनाने में, अध्ययन की जा रही बीमारी की फेनोटाइपिक विषमता पर विचार करना महत्वपूर्ण है, और इसलिए शुद्धिकरण रणनीति को विश्लेषण के लिए वांछित टी सेल आबादी प्राप्त करने के लिए आवश्यक रूप से समायोजित किया जा सकता है।
कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए टी कोशिकाओं और पीबीएमसी को उत्तेजित करने के कई तरीके हैं। हम रासायनिक सक्रियण (पीएमए + ए 23187 आयोनोफोर) पसंद करते हैं, क्योंकि हम नाभिक में जीन विनियमन में रुचि रखते हैं। रासायनिक सक्रियण इस उद्देश्य के लिए एक सबसे अच्छा विकल्प है क्योंकि यह एक व्यापक उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है और एंटीजन विशिष्ट उत्तेजना की तुलना में अधिक समान है। पीएमए एक छोटा कार्बनिक यौगिक है जो कोशिका झिल्ली के माध्यम से साइटोप्लाज्म में फैलता है, और सीधे प्रोटीन किनेज को सक्रिय करता है सी ए 23187 कैल्शियम को झिल्ली से गुजरने की अनुमति देता है। ये यौगिक सतह रिसेप्टर्स को बाईपास करते हैं, और एक साथ सीडी 28 द्वारा मध्यस्थता वाले सह-उत्तेजना के साथ टी सेल रिसेप्टर बंधाव के प्रभावों की नकल करते हैं। रसायन कई इंट्रासेल्युलर सिग्नलिंग मार्गों को सक्रिय करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप परमाणु प्रतिलेखन कारक सक्रियण और साइटोकाइन जीन के अपरेगुलेशन होते हैं जो प्रतिलेखन सक्रियण के लिए सुलभ होते हैं। यद्यपि रासायनिक सक्रियण और CD3CD28 बंधाव सामान्य कोशिकाओं32 में आश्चर्यजनक रूप से समान वैश्विक जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का उत्पादन करते हैं, पीएमए + ए 23187 के साथ रासायनिक सक्रियण एक अच्छा विकल्प है क्योंकि एसएस टी कोशिकाएं टीसीआर घटकों33 सहित सतह रिसेप्टर्स की अभिव्यक्ति खो सकती हैं। चोंग एट अल.22 ने पीएमए / ए 23187 के बीच साइटोकाइन जीन के सक्रियण की तुलना सामान्य, शुरुआती एमएफ / सीटीसीएल और देर से एमएफ / सीटीसीएल रोगियों से पीबीएमसी में एंटी-सीडी 3 और एंटी-सीडी 28 एंटीबॉडी से की। उन्होंने बताया कि पीएमए / ए 23187 ने एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 उत्तेजना की तुलना में आईएल -2 जीन के अधिक तेजी से और तीव्र सक्रियण का कारण बना। इसके अतिरिक्त, उन्होंने दिखाया कि एंटी-सीडी 3 / सीडी 28 एंटीबॉडी के साथ धीमी सक्रियण कैनेटीक्स संभावित रूप से क्रॉस-लिंकिंग और उत्तेजना के लिए आवश्यक झिल्ली सिग्नलिंग से है। इसके अलावा, अध्ययन किए गए विभिन्न सेल आबादी के बीच साइटोकिन्स की अभिव्यक्ति में रुझानों को पीएमए / ए 23187 के साथ संरक्षित किया गया था। चूंकि, हम जीन अभिव्यक्ति सक्रियण में रुचि रखते हैं, रासायनिक उत्तेजना एक आदर्श दृष्टिकोण है क्योंकि यह एक व्यापक उत्प्रेरक के रूप में कार्य करता है और एंटीजन विशिष्ट उत्तेजना की तुलना में अधिक सुसंगत है। CD3/CD28 बंधाव झिल्ली आधारित सिग्नल ट्रांसडक्शन में महत्वपूर्ण मार्गों की जांच करने के लिए आदर्श है। इसके अलावा, रासायनिक सक्रियण कम महंगा है और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है। वर्तमान अध्ययन में, पीएमए + ए 23187 ने एनडी में साइटोकाइन जीन को काफी सक्रिय किया, लेकिन एसएस टी कोशिकाओं को नहीं, यह सुझाव देते हुए कि एसएस टी कोशिकाओं में टीसीआर के डाउनस्ट्रीम में कार्यात्मक कमियां हैं।
संक्षेप में, यह प्रोटोकॉल कीमती रोगी-व्युत्पन्न रक्त से फेनोटाइपिक रूप से शुद्ध टी कोशिकाएं प्रदान करता है, और कार्यात्मक जीन अभिव्यक्ति में जीनोम-व्यापी परिवर्तनों का आकलन करने के लिए एक विधि प्रदान करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि सामान्य CD45RO + T कोशिकाओं की तुलना में एसएस टी कोशिकाओं की ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग सीटीसीएल वाले रोगियों से ताजा मानव टी कोशिकाओं में जीन सक्रियण में गहरा अंतर प्रकट करती है। ये अध्ययन सीटीसीएल में उपन्यास मार्करों को लक्षित करने वाले नैदानिक बायोमार्कर और चिकित्सीय रणनीतियों के विकास में सहायता करेंगे। इसके अलावा, प्राथमिक मानव टी कोशिकाओं का अध्ययन करने में यह रणनीति और प्रोटोकॉल अन्य टी सेल मध्यस्थता रोगों के अध्ययन के अनुकूल होने में मूल्यवान हो सकता है।
The authors have nothing to disclose.
हम उन रोगियों और स्वयंसेवकों को धन्यवाद देते हैं जिन्होंने हमारे शोध में भाग लिया।
1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
10 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
1000 ul Pipet tips | VWR | 10017-038 | |
15 ml Conical Tubes | Corning | 352196 | |
25 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170357 | |
5 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170355 | |
50 ml Conical Tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
A23187 ionophore | Fisher Scientific | BP595 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004381 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x5ml | |
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit | StemCell | 19157 | |
FBS | GIBCO | 16140-071 | |
HBSS | GIBCO | 14185-052 | |
HEPES | Fisher Bioreagents | BP310-500 | |
KHCO3 | Fisher Bioreagents | P184-500 | |
Lymphocyte Separation Medium | Corning | 25-072-CV | |
Na2EDTA | ACROS | 10378-23-1 | |
NaHCO3 | Fisher Bioreagents | S233-500 | |
NH4Cl | Fisher Bioreagents | A661-500 | |
Penicillin-streptomycin solution | GIBCO | 15140122 | |
phorbol12-myristate13-acetate (PMA) | Sigma | P-8139 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | RAININ | 17014382 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | RAININ | 17014388 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | RAININ | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | RAININ | 17014392 | |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 | |
Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | |
RPMI 1640 | GIBCO | 31800-022 | |
T-25 Flask | Thermo Scientific | 2024-10 |