Isolere mononukleære celler i humant perifert blod og CD4+ T-celler fra Sézary Syndrome-pasienter for transkripsjonsomic profilering

Summary

Vi presenterer en enkel protokoll for isolering av perifere blodmonylære celler fra fullblod hentet fra pasienter diagnostisert med Sézary Syndrome, etterfulgt av valg av CD4 + T-celler, deres stimulering med phorbol12-myristate13-acetat og A23187 ionofor, og forberedelse av RNA for transkripsjonomisk profilering.

Abstract

Kutane T-celle lymfomer (CTCL) er avledet fra transformasjonen og ukontrollert spredning av modne hud-homing T-celler, og mykose fungoider (MF) og Sézary syndrom (SS) representerer de vanligste undertypene. Til tross for en rekke studier på karakterisering av genuttrykk, genetiske endringer og epigenetiske abnormiteter av CTCL, er den molekylære patogenesen av MF / SS fortsatt uklar. MF refererer til den mer vanlige CTCL med en hud-overvekt, og er vanligvis begrenset til hud, mens SS er en aggressiv leukemisk variant av CTCL med utbredt hudinvolvering og er preget av neoplastisk distribusjon hovedsakelig involverer blod, hud og lymfeknute. Med fokus på klinisk praksis har identifisering av genuttrykksbiomarkører et enormt potensial for å forbedre diagnose og behandling av MF/SS. Faktisk har nyere transkripsjonsstudier identifisert potensielle diagnostiske biomarkører fra forskjeller i genuttrykk mellom normale og ondartede T-celler, noe som kan forbedre vår forståelse av SS-biologi, og avsløre potensielle terapeutiske mål. Dette manuskriptet beskriver en detaljert reproduserbar protokoll for isolering av perifere blodmonylære celler fra friskt fullblod fra pasienter diagnostisert med SS, utvalg av CD4+ minne T-celler (CD4 + CD45RO + T-celler), kjemisk stimulering og fremstilling av RNA egnet for transkripsjonsprofilering for å oppdage nye prognostiske molekylære markører for å få ytterligere innsikt i sykdomsetiologi. Stimuleringen ved hjelp av kjemisk agonist for å aktivere kjernefysisk regulering gir mer spesifikk vurdering for veier som er viktige i den dynamiske transkripsjonsreguleringen og genuttrykket og eliminerer forvirrende feil som kan oppstå ved oppstrøms signalfeil som oppstår fra TCR-antigentap ved cellemembranen. Dataene hentet fra sammenligning av transkripsjon av ustimulerte til stimulerte SS T-celler avdekker funksjonelle regulatoriske genuttrykksfeil som ikke fremgår av analyse av passivisert ustimulert celle. Videre kan metoden som er skissert fra denne tilnærmingen tilpasses for å studere T-cellegenuttrykksfeil i andre T-celleimmunesykdommer.

Introduction

Kutan T-celle lymfom (CTCL), inkludert de vanligste undertypene mykose fungoider (MF) og Sézary syndrom (SS), er en heterogen gruppe sykdommer avledet fra transformasjon og ukontrollert spredning av modne hud-homing T celler ^1,2. De neoplastiske T-cellene har en moden CD4 + CD45RO +, minne fenotype³, og uttrykker hud homing adhesjon markører, økende epidermotropisme⁴, som manifesterer seg som spesielt i tidlig sykdom. Det kliniske løpet av MF er ofte indolent når det er under rutinemessig administrert behandling, men en undergruppe av pasienter kan utvikle seg til mer avansert sykdom. I disse MF-tilfellene vokser og tykkere hudskader til store svulster, og neoplastiske T-celler kan spre seg til lymfeknuter og viscerale organer. I kontrast er SS en mer aggressiv, leukemisk variant av CTCL⁵, preget av en triade av symptomer: generalisert erytroderma (definert som påvirker >80% av det totale kroppsoverflateområdet), lymfadenopati og tilstedeværelse av mer enn 1000 /mm³ sirkulerende kloniske atypiske T-celler med cerebriform nuclei, såkalt Sézary celler ^6,7 . Prognosen for SS-pasienter er betydelig verre enn MF. SS er sjelden med en forekomst på 0,1/100 000, og representerer omtrent 3 % av de totale CTCL-tilfellene ^8,9. CTCL presenterer vanligvis hos eldre voksne med en median alder på ca 60 år¹⁰. Forekomsten av CTCL hadde økt, og selv om årsaken er uklar, har andelen stabilisert seg siden 1998^11,12.

Den molekylære patogenesen av SS er fortsatt uklar. Genetiske, epigenetiske og genuttrykksstudier har produsert et vell av nye data, men det er fortsatt inkonsekvente funn, hovedsakelig på grunn av de små pasientkohortene som studeres², samt forskjeller i eksperimentell design og kontrollpopulasjoner^13,14. Forbedret genomisk og trans transcriptomisk karakterisering kan belyse både sykdomsmekanismer og tidligere uutforskede terapeutiske mål. Derfor er det nødvendig med flere studier fra en større pasientpopulasjon for å bedre forstå denne heterogene maligniteten. Biomarkørpaneler som er svært følsomme og spesifikke i en SS-kohort, har prestert mindre jevnt i andre kohorter¹⁵, noe som representerer et alvorlig hinder i utviklingen av pålitelige diagnostiske og prognostiske biomarkører for SS¹⁶. Ideelle diagnostiske biomarkører vil være konsekvent og svært over-uttrykt i ondartede T-celler, mens de er fraværende eller nesten fraværende i normale T-celler¹⁷. Oppdagelsen av sykdomsspesifikke biomarkører er viktig for fremme av diagnostiske og terapeutiske protokoller for SS.

Transkripsjonsdata av høy kvalitet for både ondartede og normale T-celler krever en effektiv og pålitelig tilnærming til prøvepreparering. Her vil vi diskutere en detaljert, men enkel strategi for å få RNA-prøver fra T-cellepopulasjoner som er relevante for SS. Vi vil diskutere isolering av perifere mononukleære celler i blodet (PBMC) fra fullblod, negativt magnetisk utvalg av sykdomsrelevante CD4+CD45RO+ T-cellepopulasjoner, kjemisk aktivering for å avdekke forskjeller i funksjonelle responser og fremstilling av RNA for transkripsjonsprofilering. I den nåværende protokollen har kjemisk aktivering blitt utført ved hjelp av phorbol myristate acetat (PMA) og kalsiumionofor (A23187)^18,19, fordi tidligere studier har vist defekt T-celle reseptor signalering i CTCL, og stimulering med PMA / A23187 omgår T-celle^{reseptoren 20,21}. Også PMA / A23187 tillater en mer direkte proksimal aktivering av kjernefysiske signaler som trengs for cytokin genaktivering. Til slutt gir stimulering av T-celler et ekstra nivå av innsikt i reguleringen av genuttrykk som ikke kunne oppnås ved å hvile T-celler der dynamisk endring er fraværende.

Protocol

Menneskelige celler er potensielt smittsomme. Derfor utføres forsøkene strengt i samsvar med de nødvendige forholdsregler og prosedyrer som diskuteres som HMS og personlig verneutstyr (PVU). 1. Isolering av PBMCer fra fullblod Samle alle materialene som trengs fra tabell 1 og ta dem til romtemperatur (RT). Varm RP10F til 37 °C. Juster sentrifugen til RT. Med unntak av sentrifugering og celletelling, utfør alle trinnene ved hjelp av levedyktige celler i et biologisk sikkerhetsskap. Få blod i fem 10 ml rør (ønsket mengde) som inneholder antikoagulant. Oppbevar hele blodet ved omgivelsestemperatur (18\u201224 °C). Etikett 50 ml separasjonsrør med det menneskelige forskningsemnenummeret for blodprøven som skal behandles. Overfør 10\u201215 ml blod til hvert separasjonsrør med det samsvarende subjektnummeret. Fortynn blodet minst 2 ganger med Hanks balanserte saltoppløsning (HBSS). Ikke overskrid 35 ml fortynnet blod per rør. Forsiktig og sakte underlegg blodet med ~ 13 ml tetthetsmedium. Se gjennom det gjennomsiktige tetthetsmediet nederst på røret, og stopp pipettering når pipetten er nesten tom (for å forhindre bobleutløsning). Fjern pipetten forsiktig for å unngå å blande blod- og tetthetsmedielagene. Overfør forsiktig de fylte separasjonsrørene til sentrifugen uten å forstyrre lagene. Sentrifuge ved 500 x g i 30 min med sentrifugebremsen av (retardasjon satt til null).MERK: Hvis sentrifugen bare viser rpm, se rotorspesifikasjonene for å estimere rpm-ekvivalenten for 500 x g. Fjern separasjonsrørene forsiktig fra sentrifugen uten å forstyrre lagene. Vær oppmerksom på den buffy kappen, som har blitt dannet mellom tetthetsmediet og plasmalagene. Pipette fra toppen for å fjerne og kaste mesteparten av den øvre plasmafraksjonen, slik at 10 ml forblir over den buffy kappen. Samle forsiktig og sakte den buffy kappen. Overfør de buffy jakkene fra to separasjonsrør til et nytt forhåndsmerket og sterilt 50 ml rør, som vist i figur 1. Fortynn PBMCene minst 2 ganger med HBSS, og ta volumet i hvert nytt rør opp til 50 ml. Husk å sette sentrifugebremsen til full. Pellet PBMCs ved sentrifugering ved 400 x g i 10 min. Fjern supernatanten så mye som mulig og trykk på bunnen av røret for å løsne pelletsen. For å lyse gjenværende røde blodlegemer (RBC), resuspend hver celle pellet i 1\u20122 ml ammonium-klorid-kalium (ACK) lysis buffer per 10 ml originalt blodvolum. Inkuber i nøyaktig 5 min. Stopp straks lysis med et lik eller større volum HBSS og juster volumet til 50 ml. Sentrifuge ved 400 x g i 10 min. Fjern supernatanten og trykk på bunnen av røret for å løsne cellepellet. Bassengceller fra samme donor. Ta med volum opptil 50 ml med HBSS. Sentrifuge ved 400 x g i 10 min. Fjern supernatanten og trykk på bunnen av røret for å løsne cellepellet. Resuspend celler i 10 ml varmt RP10F medium, og ta en aliquot for levedyktig celletelling ved hjelp av trypan blå. Beregn det totale celletallet i hvert utvalg ved hjelp av et hemocytometer. 2. Rensing av CD4 + CD45RO + T-celler fra PBMCer MERK: Rensing av CD4+CD45RO+ T-celler fra PBMCer gjøres ved hjelp av kommersielt tilgjengelig magnetisk separasjon (se Tabell over materialer) med mindre modifikasjoner. Det er foretrukket å følge kit manualen for inkubasjonstid, da hvert kommersielle sett har sine egne instruksjoner. Vask ønsket mengde PBMCer i 10 ml seleksjonsbuffer. Sentrifuge ved 400 x g i 10 min. Fjern supernatanten og trykk på bunnen av røret for å løsne pelletsen. Fortynn PBMCer til 5 x 107 celler /ml i seleksjonsbuffer og overfør dem til en 5 ml polystyren rundbunnsrør (12 x 75 mm). Tilsett 50 μL antistoffcocktail per 1 ml prøve, og bland forsiktig. Inkuber ved romtemperatur i 5 min. Umiddelbart før bruk, vortex magnetiske partikler i 30 sek på høy hastighet. Tilsett 50 μL magnetiske partikler per 1 ml prøve til røret som inneholder PBMCer, og bland forsiktig. Ta volumet opp til 2,5 ml med seleksjonsbuffer og bland forsiktig. Plasser røret (uten lokk) i magneten, og inkuber ved RT i 2,5 min. Plukk opp magneten, og i en kontinuerlig bevegelse, snu magneten og røret for å helle den berikede cellefjæringen i et nytt sterilt rør. For å øke utvinningen, legg til 2,5 ml seleksjonsbuffer til røret som er igjen i magneten, uten å forstyrre de immobiliserte perlene. Hold i magneten i ytterligere 2,5 min, og gjenta trinn 2.6 for å gjenopprette flere celler. Ta en aliquot for levedyktig celletelling ved hjelp av trypan blå. Beregne det totale celletallet ved hjelp av et hemocytometer eller en celleteller. Bekreft renheten ved strømningscytometri (figur 3). 3. Kjemisk aktivering Juster CD4+CD45RO+ T-celler til 5 x 106 celler/ml med varmt RP10F-medium, og fordel celler i kulturretter av ønsket størrelse. Hvileceller i en fuktet 37 °C 5 % CO 2-inkubator over natten. Pellet uthvilte celler ved sentrifugering ved 400 x g i 10 min. Fjern supernatanten og trykk på bunnen av røret for å løsne cellepellet. Juster cellekonsentrasjonen til 5 x 106 celler/ml med varmt RP10F-medium, og fordel 0,5\u20121 x 107 celler i hver av tre sterile skruehettrør.MERK: Hvis tilstrekkelige celler er tilgjengelige, kan dupliserte stimuleringer eller ekstra tidspunkter inkluderes i eksperimentell design. Stimulere celler i rør 2 og 3 med PMA og A23187. Legg PMA til 25 ng/ml og A23187 til 500 ng/ml og bland forsiktig. Tilsett et likt volum dimetylsulfoksid (DMSO) til cellene i rør 1 som vil fungere som et kjøretøy (kontroll). Hvis du for eksempel bruker 1 μL PMA og 1 μL A23187, tilsetter du 2 μL DMSO i kjøretøyrøret. Hold den endelige konsentrasjonen av DMSO under 0,5% i alle rør. Løsne hettene på rørene, og returner cellene til 37 °C 5 % CO 2-inkubatoren i 2 timer (rør 2) og 6 timer (rør 1 og 3). På angitt tidspunkt, sentrifuger celler på 500 x g i 10 min. Før lysis, kast så mye av supernatanten som mulig, uten å forstyrre cellepelleten. Lyse cellene raskt, som anvist av instruksjoner fra det kommersielt tilgjengelige RNA-isolasjonssettet (se Materialliste). Fortsett med RNA-isolasjon, eller frys lysatet ved -80 °C for å behandle det senere med flere prøver.MERK: RNA-renhet og integritet kan verifiseres ved hjelp av mikrokapilær elektroforese. Valgfritt: For å fjerne alle spor av DNA helt fra den rensede RNA-prøven, bruk RNA-oppryddingssett (se Materialfortegnelse), i henhold til produsentens instruksjoner.

Representative Results

Denne protokollen inkluderer prosedyrer for isolering av PBMCer fra SS-blod, rensing av CD4 + CD45RO + T-celler ved negativt utvalg, stimulering av rensede T-celler og isolering av total RNA for transkripsjonsprofilering. Figur 1 beskriver prosessen med PBMC-isolasjon fra fullblod. Vær oppmerksom på at det totale utbyttet av SS PBMCs vil variere med startblodvolum og sirkulerende tumorbyrde for hver pasient. I vårt laboratorium var gjennomsnittlig utbytte av SS PBMC 4,6 × 106 celler/ml fullblod (1,85 × 106 – 3,25 x 107 celler/ml for 7 SS). Gjennomsnittlig levedyktighet for isolerte PBMCer var 95\u201299%. Figur 2 viser høy renhet og levedyktighet for utvalgte CD4+CD45RO+-minne T-celler. Gjennomsnittlig kapasitet på CD4+CD45RO+ T-celler fra SS PBMCer var 75 % (75,6 % – 84 %), sammenlignet med 15,9 % (3 % – 30 %) fra normale donorer (ND) PBMCer hentet fra leukoreduksjonssystem (LRS) kamre. Levedyktigheten og renheten til CD4+CD45RO+ T-celler oppnådd av denne negative utvalgsprotokollen har vært konsekvent høy (figur 3). Vi har tidligere kombinert aktiveringsprotokollen ovenfor med mikroarrayer for å studere de funksjonelle endringene i transkripsjonsomene til både SS- og ND T-celler, og har vist at SS-minne T-celler og SS PBMCer dårlig uttrykker cytokin og andre immunresponsgener sammenlignet med ND T-celler og PBMCer 19,22,23. Figur 4 viser robust aktivering av flere cytokingener, inkludert IL4, IL 10, IL13 og IL22 i ND T-celler, men ikke i SS T-celler. Denne feilen i funksjonelt genuttrykk i SS T-celler har siden blitt bekreftet av andre gruppe24. I tillegg er mange gener som normalt ikke uttrykkes i ND T-celler, sterkt uttrykt i SS T-celler, både i ro og etter stimulering (figur 4). Disse inkluderer de tidligere beskrevne SS biomarkørgenene DNM3, PLS3, TOX og TWIST1 25,26,27, samt ANK1 og SGCE, som først ble rapportert av vår gruppe. Disse positive biomarkørene er sterkt uttrykt i SS, men ikke ND, og unngår tekniske fallgruver forbundet med negative biomarkører. Figur 1: PBMC-isolasjon fra fullblod. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Negativt utvalg av CD4+ minne T-celler fra isolerte PBMCer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Renhet av CD4+CD45RO+ T-celler ble bekreftet av strømningscytometri. Lymfocytter ble inngjerdet av lysspredning (A), levende lymfocytter ekskludert eFluor780 levedyktighetsfargestoff (B), og (C) representerer ikke-utvalgte normale donorer (ND). Negativ seleksjon resulterte i nesten rene populasjoner av CD45RO+ T-celler hos ND(D) og SS-pasienter (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Differensialgenuttrykk i hvilende og aktiverte CD4+CD45RO+-minne T-celler fra SS og ND. Z-skår for genuttrykk representeres av en fargeskala fra rødt (høyt uttrykk) til grønt (lavt uttrykk). Fargede stenger på toppen av varmekartet representerer cellebehandlinger: mock/vehicle behandlet (rød), 2 h stimulert (blå) og 6 h stimulert (gul). Flere SS biomarkørgener er svært uttrykte og cytokingener er dårlig uttrykt i SS T-celler sammenlignet med ND T-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Reagenser Tetthet middels Lymfocyttseparasjonsmedium, ficoll-hypaque eller tilsvarende tetthetsmedium med tetthet = 1,077-1,080 g/ml ved 20oC. HBSS 1x Hanks balanserte saltoppløsning, 4,2 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7,2 RP10F RPMI 1640 medium, 10 % varmeinaktivert foster bovint serum (FBS), 1x penicillin-streptomycinoppløsning, pH 7,2 ACK lysis buffer 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, Ingen grunn til å justere pH. Det skal være ~ 7,3. Utvalgsbuffer 1x HBSS, 2% FBS, 2 mM EDTA phorbol12-myristate13-acetat (PMA) 50 μg/ml i DMSO A23187 ionofor 500 μg/ml i DMSO Tabell 1: Reagenser.

Discussion

Flere måter å isolere PBMCer på er utviklet, og hver har sine egne fordeler og begrensninger²⁸. Vi samler rutinemessig opp til 50 ml blod i fem 10 ml rør som inneholder antikoagulant. Volumet av blodet for PBMC-isolasjon avhenger av flere faktorer som helse og alder på forskningsemnet og også av phlebotomistisk kompetanse. Et kritisk prosedyretrinn i protokollen er dannelsen av trinngradienten. Dårlig lagdeling kan føre til delvis eller fullstendig svikt i PBMCer til sediment ved grensesnittet. Vi foretrekker underlagsmetoden som er beskrevet her, da det er lett å starte bunnlaget. For å fullstendig dispensere hele tetthetsmediet under blodet, er det viktig å bruke et pipethjelpemiddel uten luftlekkasjer. Forurensning av PBMC-fraksjonen av uønskede celletyper kan minimeres ved forsiktig og konsekvent innsamling av buffy-kappen, som skal utføres på samme måte for hver isolasjon. Hvis PBMCer ikke vil bli ytterligere fraksjonert, bør du unngå å samle forskjellige mengder tetthetsgradient og plasmalag mellom isolasjoner. RBC lysis utføres for å minimere den potensielle effekten av forurensende RBC- og retikulosytt-avledede RNA på nedstrøms genuttrykksanalyser. Hypotoniske lysis vil bli hemmet av overflødig isotonisk buffer.

Videre isolering av T-celleundergruppe er viktig for molekylære studier. Her beskrev vi etterfølgende CD4 + CD45RO + T celler utvalg ved negativt utvalg for å fjerne uønskede celletyper. Negativ seleksjon er avhengig av antistoffer som gjenkjenner spesifikke celleoverflatemarkører for alle uønskede celler. Antistoffbelagte celler fjernes deretter av magnetiske perler. Denne utvalgsprotokollen fjerner uønskede celler samtidig som uberørte og ustimulerte målceller forblir frie flytende, noe som er viktig for å studere genaktivering. Det må imidlertid utvises forsiktighet for å unngå celleklumper, noe som reduserer den endelige renheten til utvalgte CD4+ CD45RO+ T-celler. Etylendiamintetraketisk syre (EDTA) som finnes i seleksjonsbufferen minimerer cellekumping. Utbyttet av T-celler avhenger av faktorer som det første volumet av blodet, pasientvariabler som behandlingen som administreres til pasient- og sykdomsstadiet på tidspunktet for prøveinnsamling. Behandling gitt til pasientene kan også påvirke cellens levedyktighet. I tillegg har eksempelsamling før en prosedyre som fotoferese også positiv innvirkning på CD4 + CD45RO + T celler renhet. Vi har observert at prøveinnsamling etter fotoferesebehandlingsprosedyre har negativ innvirkning på CD4 + CD45RO + T-celler.

Neoplastiske T-cellekloner fra SS-pasienter uttrykker oftest overflatemarkører i samsvar med en moden CD4 T-cellefenotype^29,30. Fenotypisk plastisitet har imidlertid av og til blitt observert med hensyn til overflatemarkører, inkludert CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 og/eller CD26³¹. Tidligere studier har også vist heterogeniteten i CD45RO- og CD45RA-uttrykk blant SS-pasienter²⁹, mens de fleste SS-tilfeller fortsatt er CD45RO+. Roelens et ^al.31 viste også at SS kan vise interindividuell og intraindividuell heterogenitet med blandet populasjon av naiv (TN), sentralminne (TCM), overgangsminne (TTM), effektorminne (TEM) og terminaleffektorminne (TEMRA) undergrupper. Resultatene viser imidlertid tydelig at flertallet av SS-cellene har TCM-fenotype. Vi fokuserte studien vår på CD45RO+ overflateimmunofenotypen som er mest vanlig hos SS-pasienter, og bekreftet fenotype ved strømningscytometri. I planleggingsstudier av T-celleundergrupper hos pasienter er det viktig å vurdere fenotypisk heterogenitet av sykdommen som studeres, og rensestrategien kan derfor justeres etter behov for å oppnå ønsket T-cellepopulasjon for analyse.

Det er flere måter å stimulere T-celler og PBMCer til å undersøke funksjonell genuttrykk. Vi foretrekker kjemisk aktivering (PMA + A23187 ionofor), siden vi er interessert i genregulering i kjernen. Kjemisk aktivering er et best alternativ for dette formålet fordi det fungerer som en bred aktivator og er mer ensartet sammenlignet med antigenspesifikk stimulering. PMA er en liten organisk forbindelse som sprer seg gjennom cellemembranen inn i cytoplasma, og aktiverer direkte proteinkinase C. A23187 gjør at kalsium kan passere gjennom membraner. Disse forbindelsene omgår overflatereseptorer, og etterligner sammen effekten av T-cellereseptorligasjon med kostimulering formidlet av CD28. Kjemikaliene aktiverer flere intracellulære signalveier, noe som resulterer i aktivering av kjernefysisk transkripsjonsfaktor og oppregulering av cytokingener som er tilgjengelige for transkripsjonsaktivering. Selv om kjemisk aktivering og CD3CD28-ligation produserer påfallende like globale genuttrykksprofiler i normale celler³², er kjemisk aktivering med PMA + A23187 et godt valg siden SS T-celler kan miste uttrykk for overflatereseptorer inkludert TCR-komponenter³³. Chong et ^al.22 sammenlignet aktiveringen av cytokingener mellom PMA/A23187 med anti-CD3- og anti-CD28-antistoffer hos PBMCer fra normale, tidlige MF/CTCL- og sene MF/CTCL-pasienter. De rapporterte at PMA/A23187 forårsaket raskere og mer intens aktivering av IL-2-genet sammenlignet med anti-CD3/CD28-stimulering. I tillegg viste de at langsommere aktiveringskinetikk med anti-CD3 / CD28 antistoffer er potensielt fra krysskobling og membransignalering som er nødvendig for stimulering. Videre ble trender i uttrykk for cytokiner blant de forskjellige cellepopulasjonene som ble studert bevart med PMA / A23187. Siden vi er interessert i genuttrykksaktivering, er kjemisk stimulering en ideell tilnærming fordi den fungerer som en bred aktivator og er mer konsistent sammenlignet med antigenspesifikk stimulering. CD3/CD28-ligation er ideell for å undersøke veier som er viktige i membranbasert signaltransduksjon. I tillegg er kjemisk aktivering billigere og krever ikke spesialutstyr. I den nåværende studien aktiverte PMA + A23187 signifikant cytokingener i ND, men ikke SS T-celler, noe som tyder på at SS T-celler har funksjonelle mangler nedstrøms TCR.

Oppsummert gir denne protokollen fenotypisk rene T-celler fra dyrebart pasientavledet blod, og en metode for å vurdere genomomfattende endringer i funksjonelt genuttrykk. Vi viser at transkripsjonsprofilering av SS T-celler sammenlignet med normale CD45RO+ T-celler avslører dype forskjeller i genaktivering i friske humane T-celler fra pasienter med CTCL. Disse studiene vil bidra til utvikling av diagnostiske biomarkører og terapeutiske strategier rettet mot nye markører i CTCL. I tillegg kan denne strategien og protokollen for å studere primære menneskelige T-celler være verdifull i tilpasning til studier av andre T-cellemediede sykdommer.

Materials

1.5 ml microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-681-320
10 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170356
1000 ul Pipet tips	VWR	10017-038
15 ml Conical Tubes	Corning	352196
25 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170357
5 ml Disposable Plastic Pipette	Thermo Scientific	170355
50 ml Conical Tubes	Thermo Scientific	339652
A23187 ionophore	Fisher Scientific	BP595
Centrifuge	Thermo Scientific	75004381
DMSO	Sigma	D2650-5x5ml
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit	StemCell	19157
FBS	GIBCO	16140-071
HBSS	GIBCO	14185-052
HEPES	Fisher Bioreagents	BP310-500
KHCO3	Fisher Bioreagents	P184-500
Lymphocyte Separation Medium	Corning	25-072-CV
Na2EDTA	ACROS	10378-23-1
NaHCO3	Fisher Bioreagents	S233-500
NH4Cl	Fisher Bioreagents	A661-500
Penicillin-streptomycin solution	GIBCO	15140122
phorbol12-myristate13-acetate (PMA)	Sigma	P-8139
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	RAININ	17014382
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	RAININ	17014388
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	RAININ	17014391
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	RAININ	17014392
RNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	R1013
Rneasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136
RPMI 1640	GIBCO	31800-022
T-25 Flask	Thermo Scientific	2024-10