Vi presenterar ett enkelt protokoll för isolering av mononukleära celler i perifert blod från helblod erhållet från patienter som diagnostiserats med Sézarys syndrom, följt av urval av CD4 + T-celler, deras stimulering med phorbol12-myristate13-acetat och A23187 jonofor och beredning av RNA för transkriptomisk profilering.
Kutana T-cellslymfom (CTCL) härrör från transformation och okontrollerad spridning av mogna hud-homing T-celler, och mykos fungoides (MF) och Sézary syndrom (SS) representerar de vanligaste subtyperna. Trots ett antal studier om karakterisering av genuttryck, genetiska förändringar och epigenetiska avvikelser i CTCL är den molekylära patogenesen av MF / SS fortfarande oklar. MF hänvisar till den vanligare CTCL med huddominans och är vanligtvis begränsad till hud, medan SS är en aggressiv leukemisk variant av CTCL med utbredd hudengagemang och kännetecknas av neoplastisk distribution som huvudsakligen involverar blod, hud och lymfkörtel. Med fokus på klinisk praxis har identifieringen av genuttrycksbiomarkörer en enorm potential att förbättra diagnos och behandling av MF / SS. Faktum är att nyligen transkriptomiska studier har identifierat potentiella diagnostiska biomarkörer från skillnader i genuttryck mellan normala och maligna T-celler, vilket kan förbättra vår förståelse av SS-biologi och avslöja potentiella terapeutiska mål. Detta manuskript beskriver ett detaljerat reproducerbart protokoll för isolering av mononukleära celler i perifert blod från färskt helblod från patienter som diagnostiserats med SS, urval av CD4 + minnes-T-celler (CD4 + CD45RO + T-celler), kemisk stimulering och beredning av RNA som är lämplig för transkriptomisk profilering för att upptäcka nya prognostiska molekylära markörer för att få ytterligare insikt i sjukdomsetiologi. Stimuleringen med kemisk agonist för att aktivera kärnreglering ger mer specifik bedömning för vägar som är viktiga i den dynamiska transkriptionsregleringen och genuttrycket och eliminerar förvirrande defekter som kan uppstå från uppströms signaldefekter som härrör från TCR-antigenförlust vid cellmembranet. De data som erhållits från jämförelse av transkriptom av ostimulerade till stimulerade SS T-celler avslöjar funktionella reglerande genuttrycksdefekter som inte framgår av analys av vilande ostimulerade celler. Vidare kan metoden som beskrivs från detta tillvägagångssätt anpassas för att studera T-cellgenuttrycksdefekter i andra T-cellsimmunsjukdomar.
Kutan t-cellslymfom (CTCL), inklusive de vanligaste subtyperna mycosis fungoides (MF) och Sézary syndrom (SS), är en heterogen grupp av sjukdomar som härrör från transformation och okontrollerad spridning av mogna hud-homing T-celler 1,2. De neoplastiska T-cellerna har en mogen CD4 + CD45RO +, minnesfenotyp3 och uttrycker hudhoming vidhäftningsmarkörer, vilket ökar epidermotropism4, vilket manifesterar sig som utslag särskilt vid tidig sjukdom. Den kliniska kursen av MF är ofta indolent när den är under rutinmässig hanterad vård, men en delmängd av patienterna kan utvecklas till mer avancerad sjukdom. I dessa MF-fall växer hudskador och tjocknar till stora tumörer, och neoplastiska T-celler kan spridas till lymfkörtlar och viscerala organ. Däremot är SS en mer aggressiv, leukemisk variant av CTCL5, kännetecknad av en triad av symtom: generaliserat erytrodermi (definierat som att det påverkar >80% av den totala kroppsytan), lymfadenopati och närvaro av mer än 1000 / mm3 cirkulerande klonala atypiska T-celler med cerebriforma kärnor, så kallade Sézary-celler 6,7 . Prognosen för SS-patienter är signifikant sämre än MF. SS är sällsynt med en incidens på 0,1/100 000 och representerar cirka 3% av de totala CTCL-fallen 8,9. CTCL förekommer vanligtvis hos äldre vuxna med en medianålder på cirka 60 år10. Incidensen för CTCL hade ökat och även om orsaken är oklar har hastigheten stabiliserats sedan 199811,12.
Den molekylära patogenesen av SS är fortfarande oklar. Genetiska, epigenetiska och genuttrycksstudier har producerat en mängd nya data, men det finns fortfarande inkonsekventa fynd, främst på grund av de små patientkohorterna som studerats2, liksom skillnader i experimentell design och kontrollpopulationer13,14. Förbättrad genomisk och transkriptomisk karakterisering kan belysa både sjukdomsmekanismer och tidigare outforskade terapeutiska mål. Därför behövs fler studier från en större patientpopulation för att bättre förstå denna heterogena malignitet. Biomarkörpaneler som är mycket känsliga och specifika i en SS-kohort har presterat mindre enhetligt i andra kohorter15, vilket utgör ett allvarligt hinder i utvecklingen av tillförlitliga diagnostiska och prognostiska biomarkörer för SS16. Ideala diagnostiska biomarkörer kommer att vara konsekvent och mycket överuttryckta i maligna T-celler, medan de saknas eller nästan saknas i normala T-celler17. Upptäckten av sjukdomsspecifika biomarkörer är viktig för utvecklingen av diagnostiska och terapeutiska protokoll för SS.
Högkvalitativa transkriptomiska data för både maligna och normala T-celler kräver ett effektivt och tillförlitligt tillvägagångssätt för provberedning. Här kommer vi att diskutera en detaljerad men ändå enkel strategi för att erhålla RNA-prover från T-cellpopulationer som är relevanta för SS. Vi kommer att diskutera isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMC) från helblod, negativt magnetiskt urval av sjukdomsrelevanta CD4 + CD45RO + T-cellpopulationer, kemisk aktivering för att avslöja skillnader i funktionella svar och beredning av RNA för transkriptomisk profilering. I det nuvarande protokollet har kemisk aktivering utförts med användning av phorbol myristatacetat (PMA) och kalciumjonofor (A23187)18,19, eftersom tidigare studier har visat defekt T-cellsreceptorsignalering i CTCL, och stimulering med PMA / A23187 kringgår T-cellreceptorn20,21. PMA / A23187 tillåter också en mer direkt proximal aktivering av kärnsignaler som behövs för cytokingenaktivering. Slutligen ger stimulering av T-celler en ytterligare nivå av insikt i regleringen av genuttryck som inte kunde erhållas från vilande T-celler där dynamisk förändring saknas.
Flera sätt att isolera PBMC har utvecklats, och var och en har sina egna fördelar och begränsningar28. Vi samlar rutinmässigt upp till 50 ml blod i fem 10 ml rör som innehåller antikoagulantia. Blodvolymen för PBMC-isolering beror på flera faktorer som forskningspersonens hälsa och ålder och även på flebotomistisk expertis. Ett kritiskt procedursteg i protokollet är bildandet av steggradienten. Dålig skiktning kan leda till att PBMC delvis eller fullständigt misslyckas med sediment vid gränssnittet. Vi föredrar underskiktningsmetoden som beskrivs här, eftersom det är lätt att starta bottenskiktet. För att helt avge allt densitetsmedium under blodet är det viktigt att använda ett pipethjälpmedel utan luftläckage. Kontaminering av PBMC-fraktionen med oönskade celltyper kan minimeras genom noggrann och konsekvent insamling av buffybeläggningen, som bör utföras på samma sätt för varje isolering. Om PBMC inte kommer att fraktioneras ytterligare bör man undvika att samla in olika mängder av densitetsgradienten och plasmaskikten mellan isoleringarna. RBC-lys utförs för att minimera den potentiella effekten av att förorena RBC- och retikuulocyt-härledd RNA på nedströms genuttrycksanalyser. Hypotonisk lys kommer att hämmas av överskott av isotonisk buffert.
Ytterligare isolering av T-celldelmängd är viktig för molekylära studier. Här beskrev vi efterföljande CD4 + CD45RO + T-cellerval genom negativt urval för att ta bort oönskade celltyper. Negativt urval bygger på att antikroppar känner igen specifika cellytemarkörer för alla oönskade celler. Antikroppsbelagda celler avlägsnas sedan med magnetiska pärlor. Detta urvalsprotokoll tar bort oönskade celler samtidigt som orörda och ostimulerade målceller förblir fritt flytande, vilket är viktigt för att studera genaktivering. Försiktighet måste dock iakttas för att undvika cellklumpar, vilket minskar den slutliga renheten hos utvalda CD4 + CD45RO + T-celler. Etylendiamintetraättiksyra (EDTA) som finns i urvalsbufferten minimerar cellklumpning. Utbytet av T-celler beror på faktorer som blodets initiala volym, patientvariabler som behandlingen som administreras till patienten och sjukdomsstadiet vid tidpunkten för provtagningen. Behandling som ges till patienterna kan också påverka cellens livskraft. Dessutom har provinsamling före något förfarande som fotoferes också positiv inverkan på CD4 + CD45RO + T-cellernas renhet. Vi har observerat att provtagning efter fotoferesbehandlingsprocedur har negativ inverkan på CD4 + CD45RO + T-cellernas utbyte.
Neoplastiska T-cellkloner från SS-patienter uttrycker oftast ytmarkörer som överensstämmer med en mogen CD4 T-cellfenotyp29,30. Fenotypisk plasticitet har emellertid ibland observerats med avseende på ytmarkörer inklusive CD4, CD45RO, CD45RA, CD7 och/eller CD2631. Tidigare studier har också visat heterogeniteten i CD45RO- och CD45RA-uttryck bland SS-patienter29, medan majoriteten av SS-fallen fortfarande är CD45RO+. Roelens et al.31 visade också att SS kan uppvisa interindividuell och intraindividuell heterogenitet med blandad population av naiva (TN), centralminne (TCM), övergångsminne (TTM), effektorminne (TEM) och terminal effektorminne (TEMRA) delmängder. Men deras resultat visar tydligt att majoriteten av SS-cellerna har TCM-fenotyp. Vi fokuserade vår studie på CD45RO + ytimmunofenotypen som är vanligast hos SS-patienter och bekräftade fenotyp genom flödescytometri. Vid planering av studier av T-cellsundergrupper hos patienter är det viktigt att beakta fenotypisk heterogenitet hos den sjukdom som studeras, och reningsstrategin kan därför justeras efter behov för att erhålla den önskade T-cellspopulationen för analys.
Det finns flera sätt att stimulera T-celler och PBMC att undersöka funktionellt genuttryck. Vi föredrar kemisk aktivering (PMA + A23187 jonofor), eftersom vi är intresserade av genreglering i kärnan. Kemisk aktivering är ett bästa alternativ för detta ändamål eftersom det fungerar som en bred aktivator och är mer enhetlig jämfört med antigenspecifik stimulering. PMA är en liten organisk förening som diffunderar genom cellmembranet in i cytoplasman och direkt aktiverar proteinkinas C. A23187 tillåter kalcium att passera genom membran. Dessa föreningar kringgår ytreceptorer och efterliknar tillsammans effekterna av T-cellreceptorligering med samstimulering medierade av CD28. Kemikalierna aktiverar flera intracellulära signalvägar, vilket resulterar i nukleär transkriptionsfaktoraktivering och uppreglering av cytokingener som är tillgängliga för transkriptionsaktivering. Även om kemisk aktivering och CD3CD28-ligering ger påfallande liknande globala genuttrycksprofiler i normala celler32, är kemisk aktivering med PMA + A23187 ett bra val eftersom SS T-celler kan förlora uttryck av ytreceptorer inklusive TCR-komponenter33. Chong et al.22 jämförde aktiveringen av cytokingener mellan PMA/A23187 med anti-CD3- och anti-CD28-antikroppar i PBMC från normala, tidiga MF/CTCL- och sena MF/CTCL-patienter. De rapporterade att PMA /A23187 orsakade snabbare och intensivare aktivering av IL-2-genen jämfört med anti-CD3/CD28-stimulering. Dessutom visade de att den långsammare aktiveringskinetiken med anti-CD3 / CD28-antikroppar potentiellt kommer från tvärbindning och membransignalering som är nödvändig för stimulering. Vidare bevarades trender i uttryck av cytokiner bland de olika studerade cellpopulationerna med PMA/A23187. Eftersom vi är intresserade av genuttrycksaktivering är kemisk stimulering ett idealiskt tillvägagångssätt eftersom det fungerar som en bred aktivator och är mer konsekvent jämfört med antigenspecifik stimulering. CD3/CD28-ligering är idealisk för att undersöka vägar som är viktiga vid membranbaserad signaltransduktion. Dessutom är kemisk aktivering billigare och kräver ingen specialutrustning. I den aktuella studien aktiverade PMA + A23187 signifikant cytokingener i ND men inte SS T-celler, vilket tyder på att SS T-celler har funktionella brister nedströms TCR.
Sammanfattningsvis tillhandahåller detta protokoll fenotypiskt rena T-celler från dyrbart patienthärledt blod och en metod för att bedöma genomomfattande förändringar i funktionellt genuttryck. Vi visar att transkriptomisk profilering av SS T-celler jämfört med normala CD45RO + T-celler avslöjar djupa skillnader i genaktivering i färska mänskliga T-celler från patienter med CTCL. Dessa studier kommer att bidra till utvecklingen av diagnostiska biomarkörer och terapeutiska strategier riktade mot nya markörer i CTCL. Dessutom kan denna strategi och protokoll för att studera primära humana T-celler vara värdefulla för att anpassa sig till studier av andra T-cellmedierade sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar de patienter och volontärer som deltagit i vår forskning.
1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
10 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
1000 ul Pipet tips | VWR | 10017-038 | |
15 ml Conical Tubes | Corning | 352196 | |
25 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170357 | |
5 ml Disposable Plastic Pipette | Thermo Scientific | 170355 | |
50 ml Conical Tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
A23187 ionophore | Fisher Scientific | BP595 | |
Centrifuge | Thermo Scientific | 75004381 | |
DMSO | Sigma | D2650-5x5ml | |
EasySep Human Memory CD4+ T cell Enrichment Kit | StemCell | 19157 | |
FBS | GIBCO | 16140-071 | |
HBSS | GIBCO | 14185-052 | |
HEPES | Fisher Bioreagents | BP310-500 | |
KHCO3 | Fisher Bioreagents | P184-500 | |
Lymphocyte Separation Medium | Corning | 25-072-CV | |
Na2EDTA | ACROS | 10378-23-1 | |
NaHCO3 | Fisher Bioreagents | S233-500 | |
NH4Cl | Fisher Bioreagents | A661-500 | |
Penicillin-streptomycin solution | GIBCO | 15140122 | |
phorbol12-myristate13-acetate (PMA) | Sigma | P-8139 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | RAININ | 17014382 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+ | RAININ | 17014388 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | RAININ | 17014391 | |
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | RAININ | 17014392 | |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1013 | |
Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | |
RPMI 1640 | GIBCO | 31800-022 | |
T-25 Flask | Thermo Scientific | 2024-10 |