Hier wird eine Methode zur Untersuchung der Rollen der Na + /K +Pumpe und des persistenten Na+ Stroms in Blutegelherzinteruronen mittels dynamischer Klemme vorgestellt.
Die Na+/ K+ Pumpe, oft als Hintergrundfunktion in der neuronalen Aktivität betrachtet, trägt einen äußeren Strom (I-Pumpe) bei, der auf die innere Konzentration von Na+ ([Na+]i) reagiert. Bei platzenden Neuronen, wie sie in neuronalen Netzwerken des zentralen Mustergenerators (CPG) zu finden sind, die rhythmische Bewegungen erzeugen, kann erwartet werden, dass das [Na+]i und damit die I-Pumpe während des Burst-Zyklus variieren. Diese Reaktionsfähigkeit auf elektrische Aktivität, kombiniert mit der Unabhängigkeit vom Membranpotential, verleiht I-Pumpen dynamische Eigenschaften, die bei kanalbasierten Strömen (z. B. spannungs- oder transmittergesteuerte oder Leckkanäle) nicht üblich sind. Darüber hinaus wird in vielen Neuronen die Aktivität der Pumpe durch eine Vielzahl von Modulatoren moduliert, was die potenzielle Rolle der I-Pumpe bei der rhythmischen Bursting-Aktivität weiter erweitert. Dieser Artikel zeigt, wie man eine Kombination aus Modellierungs- und dynamischen Klemmmethoden verwendet, um zu bestimmen, wie ichpumpe und seine Wechselwirkung mit persistentem Na+ Strom die rhythmische Aktivität in einem CPG beeinflusst. Insbesondere wird sich diese Arbeit auf ein dynamisches Klemmprotokoll und computergestützte Modellierungsmethoden in Herzinterneuren von medizinischen Blutegeln konzentrieren.
Der Herzschlag in Blutegeln wird durch ein CPG angetrieben, das aus 9 bilateralen Paaren von Herzinterneurinen (HNs) besteht, die über möglichst viele Segmentganglien im mittleren Körper verteilt sind. Im Kern des CPG befinden sich gegenseitig hemmende Paare von Interneuronen, die sich in den3. und4. Segmentganglien befinden und halbzentrische Oszillatoren (HCOs) bilden (Abbildung 1A). Diese Neuronen platzen weiterhin, wenn sie synaptisch pharmakologisch mit Bikukullin 1 isoliertwerden. Andere, wie das Paar in den 7. Segmentganglien (der Fokus dieses Protokolls), sindebenfalls Burster, die in der Lage sind, bursting Aktivität zu erzeugen, wenn sie synaptisch isoliert sind. Sie sind nicht miteinander verbunden und erhalten nur absteigenden Input und können daher leicht isoliert werden, indem das Ganglion vom Rest des Nervenstrangs getrennt wird. Diese unabhängige Berstaktivität ist empfindlich gegenüber eingebrachtem Ableitstrom, der durch das Eindringen mit scharfen Mikroelektroden zur Aufzeichnung verursacht wird, aber bei Der Aufzeichnung mit losen Patch-Methoden stark geplatztist 1.
Sowohl einzelne HN-Neuronen als auch HN-HCOs wurden modelliert (Hodgkin-Huxley-basierte Einzelisopotentialkompartimentmodelle von HN-Neuronen, die alle experimentell identifizierten spannungsgesteuerten und synaptischen Ströme enthalten), und alle Burst-Eigenschaften des lebenden Systems wurden erfolgreich erfasst2. Myomodulin, ein endogenes Neuropeptid in Blutegeln, verringert deutlich die Periode (T) des Burst-Rhythmus isolierter HN-Neuronen und HN-HCOs. Dieser Modulator wirkt, um den h-Strom (hyperpolarisationsaktivierter Innenstrom, Ih)zu erhöhen und die I-Pumpe3zu verringern. Diese Beobachtung führte zur Untersuchung, wie ich mit Ih interagiere und wie ihre Co-Modulation zur rhythmischen Aktivität von HN-Neuronen beiträgt. Die Aktivierung der Pumpe durch Erhöhung von [Na+]i (unter Verwendung des Ionophormonensins) beschleunigt den HN-Burst-Rhythmus sowohl in HN-HCOs als auch in isolierten HN-Neuronen4. Diese Beschleunigung war abhängig von Ih. Als Ih blockiert wurde (2 mM Cs+), wurde die Burst-Periode durch diese Methode der Pumpenaktivierung nicht verändert; Die Burstdauer (BD) wurde jedoch verkürzt und das Interburst-Intervall (IBI) nahm sowohl bei HN-HCOs als auch bei isolierten HN-Neuronenzu 4.
Für dieses Protokoll werden alle Ströme eines lebenden HN(7)-Neurons, einschließlich des Pumpenstroms, I-Pumpe,wie folgt in das HN-Modell integriert:
(1)
wobei C die Membrankapazität (in nF), V das Membranpotential (in V), t die Zeit (in s) ist. Detaillierte ionische Strombeschreibungen und Gleichungen wurden an anderer Stelle beschrieben2,4. Das komplette HN-Modellneuron läuft in Echtzeit (Abbildung 2). Die Software wird nach der Veröffentlichung auf GitHub zur Verfügung gestellt und ist für die Ausführung auf der in der Materialtabelle beschriebenendigitalen Signalverarbeitungsplatine geeignet. Hier liegt der Schwerpunkt der Untersuchung auf dem Na+/ K+ Pumpenstrom (IPumpe) und den spannungsgesteuerten Strömen, die signifikante Na+ Fluss beitragen: ein schneller Na+ Strom (INa) und ein anhaltender Na+ Strom (IP). Die maximalen Leitfanzen dieser Ströme sind
jeweils. Die Na+/ K+ Pumpe tauscht drei intrazelluläre Na+ Ionen gegen zwei extrazelluläre K+ Ionen aus und erzeugt so einen Nettoauswärtsstrom. Wichtig ist, dass es 3-mal so viel Na+ aus dem Neuron pumpt, wie dieser Strom anzeigt, was für die Berechnung der intrazellulären Na+ -Konzentration wichtig ist.
Der Na+/K+ Pumpenstrom hängt von intrazellulären Na+ Konzentrationen ab und wird durch die folgende Sigmoidalfunktion ausgedrückt:
(2)
wobei [Na]i die intrazelluläre Na+ -Konzentration ist, der maximale Na+/ K+ Pumpenstrom ist, [Na]ih die intrazelluläre Na+ -Konzentration für die Halbaktivierung der Na+/ K+ -Pumpe und [Na] die Empfindlichkeit der Na+/ K+ -Pumpe gegenüber [Na]i ist. [Na]i baut sich als Ergebnis der Na+ -Zuflüsse auf, die von IP und INa getragen werden, und wird durch den Na+ Ausfluss der Na+ /K+ Pumpe verringert. Der Beitrag von Ih und ILeak zum gesamten Na+ Fluss ist gering und wird im Echtzeitmodell nicht berücksichtigt.
(3)
dabei ist v das Volumen (~6,7 pL) des intrazellulären Na +-Reservoirs, F ist die Faradays konstante und die extrazelluläre Na+ -Konzentration wird konstant gehalten.
Spannungsgesteuerte und Leckleitstände wurden unterschieden – diese reagieren auf Membranpotential – vom Pumpenstrom, der durch die berechnete intrazelluläre Na+ -Konzentration ([Na+]i) reguliert wird. [Na+] i wird durch Na+ Eintritt über den schnellen Na+ Strom (INa) aufgebaut, der Aktionspotentiale (Spikes) und den persistenten Na+ Strom (IP) erzeugt, der die Depolarisation zur Unterstützung von Spiking bereitstellt. [Na+] i wird wiederum durch die Wirkung der Pumpe durch die Extrusion von Na+reduziert. Es wurden lebende HN-Werte von (5nS) und
(150 nS) angenommen, und wir berücksichtigen jede zusätzliche dynamische
Klemme.
Das Ziel des hier beschriebenen Protokolls ist es, IPump präzise und reversibel in Echtzeit zu manipulieren, um herauszufinden, wie es mit spannungsgesteuerten Strömen (persistenter Na+ Strom im Stromprotokoll) interagiert, um rhythmisches Bursting in einzelnen HNs zu steuern. Um dieses Ziel zu erreichen, wurde eine dynamische Klemme verwendet, die auf Befehl künstlich eine genaue Menge eines strombasierten Stroms einführt, der während des Modelllaufs berechnet werden kann. Diese Methode hat Vorteile gegenüber der pharmakologischen Manipulation der Pumpe, die das gesamte Gewebe betrifft, Off-Target-Effekte haben kann, die oft schwer rückgängig zu machen sind und nicht genau manipuliert werden können. DynamischeKlemme 5,6 liest die Spannung eines aufgezeichneten Neurons in Echtzeit ( Abbildung1B) und berechnet und injiziert in Echtzeit die Menge eines beliebigen Stroms basierend auf Modellgleichungen und den Sollwerten eines beliebigen oder
. Ähnliche Methoden können leicht auf jedes Neuron angewendet werden, das intrazellulär aufgezeichnet werden kann. Die Parameter müssen jedoch auf das gewählte Neuron neu skaliert werden, und das Neuron sollte aus synaptischen Inputs isoliert werden, z. B. pharmakologisch.
Modellierung, dynamische Klemme und die daraus resultierenden Analysen sind nützliche Techniken, um zu untersuchen, wie einzelne und Gruppen von Ionenleitfähigkeit/-strömen zur elektrischen Aktivität von Neuronen beitragen (Abbildung 1, Abbildung 2,Abbildung 4und Abbildung 5). Die Verwendung dieser Techniken zeigt, wie der Na+/ K+ Pumpenstrom (I-Pumpe) mit spannungsgesteuerten Strömen interagiert, insbesondere dem persistenten Na+ Strom (IP), um ein robustes Platzen in den Kern-HNs des Blutegel-Herzschlagmustergenerators zu fördern. Durch die Kombination von dynamischen Klemmexperimenten und Modellierung ist es möglich, Modelle direkter zu testen, als es mit gewöhnlichen Spannungsaufzeichnungs- und Stromzangetechniken möglich ist. Die Ergebnisse der dynamischen Klemmexperimente (Abbildung 5) werden zur weiteren Verfeinerung des HN-Modells verwendet. Die hier demonstrierte grundlegende Methode der dynamischen Klemmung kann angepasst werden, um die Eigenschaften jedes untersuchten Neurons widerzuspiegeln, wenn ein mathematisches Modell neuronaler Ströme mit Spannungsklemmexperimenten bestimmt werden kann.
Der erfolgreiche Abschluss der Experimente der hier gezeigten Art erfordert eine sorgfältige Aufspießung eines HN oder eines anderen Neurons bei Verwendung einer scharfen Mikroelektrode, da starkes Platzen durch Elektrodenpenetration1eingedämmt wird. (Ganzzell-Patch-Aufzeichnungstechniken, die eingeführte Lecks minimieren, sind auch auf andere Neuronen anwendbar, funktionieren aber nicht gut auf Blutegelneuronen.) Es ist wichtig, dass die Aufspießung des HN-Neurons minimale Schäden am Neuron verursacht (zusätzliches Leck), und der Eingangswiderstand sollte überwacht werden und muss im Bereich von 60-100 MOhms für erfolgreiche Experimenteliegen 4.
Dynamische Klemme ist eine mächtige Technik, aber sie hat Einschränkungen durch neuronale Geometrie, da die künstlichen Leitfäden an der Stelle der Aufzeichnungselektrode – normalerweise dem Zellkörper – implementiert werden, nicht an der Stelle, an der rhythmuserzeugendeStrömenormalerweise lokalisiert sind 5,6,10. In Blutegel-HN-Neuronen befindet sich der Zellkörper elektrisch nahe an der Integrationszone (Hauptneurit) des Neurons, wo die meisten aktiven Ströme lokalisiert und Spikes initiiert werden.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Christian Erxleben für vorläufige dynamische Klemmexperimente an HN(7)-Neuronen, die ihre Berstfähigkeiten demonstrierten. Angela Wenning unterstützte die Experimente mit fachkundiger Beratung. Wir danken dem NIH für die Finanzierung dieser Arbeit durch Grant 1 R21 NS111355 an GSC und RLC.
ANIMALS | |||
Hirudo verbana | Leech.com, https://www.leech.com/collections/live-leeches | live leeches 2-3 grams | |
CHEMICALS | |||
ARTIFICIAL POND WATER | |||
CaCl2 | Sigma Aldrich | C5670-100G | 1.8 mM add last after adjusting pH |
glucose | Sigma Aldrich | G7021-100G | 10 mM |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034-100G | 10 mM |
Instant Ocean (sea salt ) | Spectrum Brands Inc., Madison, WI | 0.05% (w/v) diluted in deionized water | |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 4 mM |
NaCl | Sigma Aldrich | S7653-250G | 115 mM |
NaOH 0.1 N Solution | Sigma Aldrich | 2105-50ML | Adjust to pH 7.4 with NaOH |
MICROELECTRODES | |||
K Acetate | Sigma Aldrich | P1190-100G | 2 M |
KCl | Sigma Aldrich | P9333-500G | 20 mM |
SALINE | |||
EQUIPMENT | |||
#5 Forceps | Fine Science Tools Dumont | 11251-30 OR 11251-20 | For general leech dissection |
AxoClamp 2A/2B DCC electrometer | Axon Instruments Molecular Devices | 2A/2B | For recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Black resin | Dow Sylguard | 170 | Lines general dissect dish |
Capilary glass 1 mm outer diameter, 0.75 mm inner diameter | A-M Systems | 615000 | For fabricating sharp microelectrodes |
Clear resin | Dow Sylguard | 184 | Lines Petri dish used to mount ganglion for electrophysilogy |
Dark field condenser | Nikon | Dry 0.95-0.80 MBL 1210 | For illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Digidata 1440A | Axon CNS Molecular Devices | 1440A | Performs A to D and D to A for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Digital signal processing board | dSpace | CLP1104 | Our software implements all the conductances/currents in our model HN neuron on a DS1103 dSPACE PPC Controller Board in real-time at a rate of 20 kHz with a ControlDesk GUI (dSPACE, Paderborn, Germany)9. |
Falming/Brown Microelectrode Puller | Sutter Instruments | P-97 | For fabricating sharp microelectrodes |
Fiber-Lite high intensity illuminator | Dolan Jenner Industries | 170D | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Headstage amplifier for AxoClamp 2A | Axon Instruments | HS-2A Gain:0.1LU | Now part of Molecular Devices for recording of neuronal membrane potential and discontinuous current clamp |
Light guide | Dolan Jenner Industries | Rev R 38 08 3729107 | For illuminating the general dissection and for illuminating the ganglion preparation during cell impalement |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-385 | Micromanipulator for cell impalement with microelectrodes |
Micromanipulator controller | Sutter Instruments | MPC-200 | Controls micromanipulators for cell impalement with microelectrodes |
Minuten pins | BioQuip | 0.15 mm diameter 1208SA | Should be shortened by curtting to ~5 mm |
Optical Breadboard 3' x 5' x 8" | Newport | Obsolete | With the 4 pneumatic Isolators below used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Oscilloscope | HAMEG Instruments | HM303-6 | To monitor electrode setteling during DCC |
Pascheff-Wolff spring scissors | Moria | Supplied by Fine Science Tools (Foster City, CA) catalog # 15371-92 | |
pClamp 9 Software | Axon Instruments | 9 | Now part of Moleculear Devices uses the Digidata 1440 for data acquisition and stimulation during electrophysiology |
Pneumatic Isolators 28" | Newport | Obsolete | With optical breadboard used to construct a vibration free workspace for electrophysiology |
Simulink / MATLAB software | MathWorks | 2006 (Obsolete) | Implements dynamic clamp on the digital signal processing board |
Stereomicroscope | Wild | M5A | 10x Eye Pieces used for dissecting the leech and removingand desheathing ganglia |
Steromicroscope | Wild | M5 | 20x Eye Pieces used in electrophysiologcal station to visualize neuron for microelectrode penetration |
Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | For general leech dissection |