설치류에 있는 허혈성 망막 질병을 위한 산소 유도한 망막병증 모형
Summary
산소 유발 망막병증(OIR)은 미숙아 및 증식 성 당뇨병 망막증의 망막병증과 같은 허혈성 망막 질환을 모델링하고 신생아 질환에 대한 항 혈관 신생 약물을 평가하는 개념 증명 연구의 모델로 사용될 수 있다. OIR는 정량화 될 수있는 망막에서 견고하고 재현 가능한 신생 혈관화를 유도합니다.
Abstract
허혈성 망막증에 일반적으로 사용되는 모델 중 하나는 산소 유발 망막병증 (OIR) 모델입니다. 여기에서 우리는 마우스와 쥐 둘 다에 있는 OIR 모형 유도 및 그것의 판독을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다. 망막 신생 혈관화는 중구 성 새끼를 hyperoxia (마우스) 또는 hyperoxia 및 저산소증 (쥐)의 교대 수준을 노출시킴으로써 OIR에서 유도됩니다. 이 모형의 1 차적인 판독은 망막에 있는 신생혈관 (NV) 및 avascular (AVA) 지역의 크기입니다. 생체 내이 전임상 은 잠재적인 항 혈관 신생 약물의 효능을 평가하거나 유전자 조작 된 동물을 사용하여 망막 혈관 신생에서 특정 유전자의 역할을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 이 모델에는 실험을 설계할 때 고려해야 할 OIR 유도에 약간의 변형 및 공급업체별 변형이 있습니다.
Introduction
안정적이고 재현 가능한 실험 모델은 혈관 신생 안구 질환의 병리학을 연구하고 이러한 치명적인 질병에 대한 새로운 치료법을 개발하는 데 필요합니다. 병리학적 혈관신생은 습한 노화 관련 황반 변성(AMD)과 미숙아(ROP), 증식성 당뇨병 성 망막병증(PDR) 및 망막 정맥 폐색(RVO)1,2,3,4의망막병증의 망막병증을 위한 특징이다. 인간과 설치류 망막은 인간과 설치류 망막이 혈관화되는 마지막 조직 중 하나이기 때문에 유사한 발달 패턴을 따릅니다. 망막 혈관이 완전히 발달하기 전에 망막은 히알로이드 혈관에서 영양 공급을 받는데, 이는 망막 혈관이1,2를개발하기 시작할 때 회귀한다. 인간에서는 망막 혈관 발달이 출생 전에 완료되는 반면 설치류에서는 망막 혈관의 성장이 출생 후에 발생합니다. 망막 혈관 발달은 설치류에서 산후에서 발생하기 때문에 혈관 신생2,3을연구하기에 이상적인 모델 시스템을 제공한다. 신생아 설치류는 완전한 혈관 망막 발달이 3 차 산후 주4의말까지 달성 될 때까지 점차적으로 발생하는 혈관 망막을 가지고 있습니다. 신생아 마우스의 성장 혈관은 플라스틱, 그들은 hyperoxia 자극 동안 회귀를겪는다 5.
ROP는 1,250 g6,7의밑에 출생 무게를 가진 미숙아의 거의 70%에 영향을 미치기 때문에, 서양 국가에 있는 유년기 실명에 대한 주요한 원인입니다. ROP는 망막 혈관이 정상 성장을 완료하기 전에 태어난 미숙아에서 발생합니다. ROP는 2단계로 진행한다: 단계 I에서, 조산은 망막 혈관 성장을 지연시키는 단계 II에서, 개발망티나의 미완성 혈관화는 새로운 및 비정상적인 혈관 성장을 자극하는 혈관신생 성장 인자의 발현을 유도하는 저산소증을 일으킨다8. OIR 모델은 ROP 및 기타 허혈성 망막증의 병리학을 연구하고 새로운 약물 후보2,3,9를테스트하는 데 널리 사용되는 모델입니다. 그것은 널리 안구뿐만 아니라 비 안구 질환에 대한 잠재적 인 항 혈관 유발 약물에 대한 개념 증명 연구를 수행하기위한 재현 가능한 모델로 간주됩니다. 두 설치류 모델 즉, 마우스와 쥐 OIR는 모델 유도 및 질병 표현형이 다릅니다. 쥐 모델은 ROP 표현형을 보다 정확하게 모방하지만 마우스 모델은 망막 신생 혈관화 (NV)를 위한 보다 강력하고 빠르며 재현 가능한 모델을 제공합니다. 마우스 모델에서 NV는 중앙 망막으로 발전합니다. 이러한 병리학적 판독은 PDR, RV 및 발출 AMD와 같은 많은 허혈성 망막병증뿐만 아니라 암과 같은 비안구, 혈관신생 질환에 대한 약리효능 연구에서 중요합니다. 더욱이, 유전자 조작 (형질전환 및 녹아웃) 마우스의 가용성은 마우스 OIR 모델을 더 인기있는 옵션으로 만든다. 그러나 마우스나 쥐 OIR 모델은 인간 질환에서 전형적인 망막 섬유증을 생성하지 않습니다.
높은 산소 수준이 1950년대10,11년에 ROP의 발달에 기여했다는 이해는 동물 모형의 발달로 이끌어 냈습니다. 망막 혈관에 산소의 효과에 대한 첫 번째 연구는 1950년 12,13,14및 1990 년대까지 OIR 모델에 많은 정제가 있었다. 1994년 스미스 외(Smith) 등의 연구는 히알로이도병증과망막병증(15)을분리하는 현재 마우스 OIR 모델에 대한 표준을 세웠다. 코너 등(2009)에 의해 혈관 소성 및 병리학적 NV를 정량화하는 방법의 폭넓은 채택은 그 인기를 더욱 높였다16. 이 모델에서, 마우스는 P7에서 5일 동안 75%의 산소(O2)에배치되고, 그 다음으로 5일 동안 노목성 조건에서 배치된다. P7에서 P12까지의 Hyperoxia는 망막 중앙망막에서 회귀하는 망막 혈관을 일으키는 원인이 됩니다. 노목학적 조건으로 돌아오면 혈관 망막이 저산소가됩니다(도 1A). 바낭 중앙 망막의 저산소 자극으로 인해 망막 혈관 중 일부는 유리체쪽으로 싹이 나고, 전리동맥 NV를 형성하여2,3. 이 터프트는 미숙하고 과과성입니다. P17에서 NV 피크의 양이 재생됩니다. 망막은 완전히 재변되고 NV는 P23 – P25(그림 2A)2,3에의해 완전히 회귀된다.
쥐 OIR 모델 (O2의다양한 수준을 사용하여) 먼저 80 % 및 40 %에서 O2 수준이 80 % 이하보다 더 발음 NV를 일으키는 것을 보여주는 1990 년대에 설명되었다 80% O2 상수 노출17. 나중에 O2가 과옥시아 (50 %)에서 순환되는 간헐적 저산소증 모델이 발견되었습니다. 저산소증(10-12%)으로 인해 80/40% O2 모델18보다더 많은 NV가 발생합니다. 50/10% 모델에서 쥐 새끼는 24시간 동안 50%에 노출되고, 10% O2에서24시간 동안 노출됩니다. 이러한 주기는 P14까지 계속되며, 쥐 새끼가 노목학적조건(도 1B)으로반환될 때 계속됩니다. 인간 ROP 환자에서와 마찬가지로, 쥐 모델에서, 변기 부위는 미성숙한 망막 혈관 신경총(도3)으로인해 망막 주변으로 발전한다.
두 모델 모두에서 일반적으로 정량화되는 주요 매개 변수는 AVA 및 NV의 크기입니다. 이러한 파라미터는 전형적으로 내피 세포가4,16으로표지되는 망막 플랫 마운트로부터 분석된다. 이전에는 전리동맥 NV의 양이 혈관 또는 혈관 세포 핵을 내부 제한 막 이상으로 유리체로 확장하여 망막 단면으로부터 평가하였다. 이 방법의 주요 제한은 AVA를 정량화할 수 없다는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
질병 표현형의 중증도는 마우스와 쥐 OIR모델(23)의균주와 공급업체 모두에 의존한다. 이것은 병리학 발달에 있는 넓은 genotypic 가변성이 있다는 것을 건의합니다. 일반적으로, 색소 설치류는 알비노 보다 더 심각한 표현형을 개발. 예를 들어, 알비노 BALB/c의 망막 혈관은 과옥증 후 급속히 변조되고24전혀NV를 개발하지 않는다. 유사하게, 쥐에서, 색소 브라운 노르?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
마리안 칼스버그, 앤 마리 하파니에미, 피비 파르타넨, 앤 칸쿠넨에게 훌륭한 기술 지원을 해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 핀란드 아카데미, 피비키키 및 사카리 솔베르크 재단, 탐페레 결핵 재단, 핀란드 의학 재단, 피르칸마 병원 지구 연구 재단 및 탐페레 대학 병원 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
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