Syreinducerad retinopatimodell för ischemiska näthinnesjukdomar hos gnagare
Summary
Syreinducerad retinopati (OIR) kan användas för att modellera skandinaviska näthinnesjukdomar såsom retinopati av prematuritet och proliferativ diabetes retinopati och att fungera som en modell för proof-of-concept studier vid utvärdering av antiangiogenic läkemedel för neovaskulära sjukdomar. OIR inducerar robust och reproducerbar neovaskularisering i näthinnan som kan kvantifieras.
Abstract
En av de vanliga modellerna för skandinaviska retinopatier är den syreinducerade retinopatimodellen (OIR). Här beskriver vi detaljerade protokoll för OIR-modellens induktion och dess avläsningar hos både möss och råttor. Retinal neovascularization induceras i OIR genom att utsätta gnagare valpar antingen för hyperoxia (möss) eller alternerande nivåer av hyperoxia och hypoxi (råttor). De primära avläsningarna av dessa modeller är storleken på neovaskulära (NV) och avascular (AVA) områden i näthinnan. Denna prekliniska in vivo-modell kan användas för att utvärdera effekten av potentiella antiangiogena läkemedel eller för att ta itu med specifika geners roll i näthinnans angiogenes med hjälp av genetiskt manipulerade djur. Modellen har en viss stam- och leverantörsspecifik variation i OIR-induktionen som bör beaktas vid utformningen av experimenten.
Introduction
Tillförlitliga och reproducerbara experimentella modeller behövs för att studera patologin bakom angiogena ögonsjukdomar och för att utveckla nya terapier till dessa förödande sjukdomar. Patologisk angiogenes är kännetecknet för våt åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och för många skandinaviska näthinnesjukdomar bland dem retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetiker retinopati (PDR) och näthinnevenocklusion (RVO)1,2,3,4. Mänskliga och gnagare retinas följer ett liknande utvecklingsmönster, eftersom både mänskliga och gnagare näthinnan är bland de sista vävnaderna som är vascularized. Innan näthinnan vaskulaturen har utvecklats helt, får näthinnan sin näringstillförsel från hyaloid vaskulatur, som i sin tur går tillbaka när näthinnans vaskulatur börjar utvecklas1,2. Hos människa slutförs retinal vaskulär utveckling före födseln, medan tillväxten av retinal vaskulatur hos gnagare sker efter födseln. Eftersom retinal vaskulär utveckling sker postnatally hos gnagare, ger det ett idealiskt modellsystem för att studera angiogenesen2,3. Nyfödda gnagare har en avascular näthinnan som utvecklas gradvis tills fullständig vaskulär näthinnan utveckling uppnås i slutet av tredje postnatala vecka4. De växande blodkärlen hos neonatalmus är plast, och de genomgår regression under hyperoxiastimulans5.
ROP är den främsta orsaken till barndomsblindhet i västländer, eftersom det påverkar nästan 70% av de för tidigt födda med födelsevikt under 1 250 g6,7. ROP förekommer hos för tidigt födda spädbarn som föds innan näthinnekärlen slutför sin normala tillväxt. ROP fortskrider i två faser: i fas I, prematur födsel fördröjer retinal Vaskulär tillväxt där efter i fas II, oavslutad Vascularization av den utvecklande näthinnan orsakar hypoxi, vilket inducerar uttryck av angiogenic tillväxtfaktorer som stimulerar nya och onormala blodkärl tillväxt8. OIR-modellen har varit en allmänt använd modell för att studera patofysiologin hos ROP och andra skandinaviska retinopatier samt för att testa nya läkemedelskandidater2,3,9. Det anses allmänt vara en reproducerbar modell för att utföra proof-of-concept studier för potentiella antiangiogenic läkemedel för okulär samt icke-okulär sjukdomar. De två gnagarmodellerna, dvs. mus och råtta OIR skiljer sig åt i sin modell induktion och sjukdom fenotyp. Råttmodellen efterliknar ROP fenotyp mer exakt, men musmodellen ger en mer robust, snabb och reproducerbar modell för retinal neovascularization (NV). I musmodellen utvecklas NV till den centrala näthinnan. Denna patologiska avläsning är viktig i farmakologiska effektstudier för många skandinaviska retinopatier, såsom PDR, RV och exudativ AMD samt för icke-okulära, angiogena sjukdomar som cancer. Dessutom gör tillgången på genetiskt manipulerade (transgena och knockout) möss musens OIR-modell till ett mer populärt alternativ. Men varken mus eller råtta OIR modell skapar näthinnefibros, vilket är typiskt vid mänskliga sjukdomar.
Förståelsen att höga syrenivåer bidrar till utvecklingen av ROP på 1950-talet10,11 ledde till utvecklingen av djurmodeller. De första studierna om syrets effekt på retinalvaskulatur gjordes 195012,13,14 och fram till 1990-talet fanns det många förbättringar av OIR-modellen. Forskningen av Smith et al. 1994 satte en standard för den nuvarande mus OIR-modellen som skiljer hyaloidopati från retinopati15. En bred användning av metoden för att kvantifiera vaso-utplåning och patologisk NV av Connor et al. (2009) ökade ytterligare dess popularitet16. I denna modell placeras möss på 75% syre (O2) i 5 dagar vid P7, följt av 5 dagar i normoxiska förhållanden. Hyperoxia från P7 till P12 orsakar retinal vaskulatur att regress i centrala näthinnan. Vid återgång till normoxiska tillstånd blir avaskulär näthinna hypoxisk (figur 1A). På grund av de hypoxiska stimuli i den avaskulära centrala näthinnan spirar några av näthinnans blodkärl mot glaskroppen och bildar preretinal NV, kallad preretinal tufts2,3. Dessa tufts är omogna och hyperpermeable. Mängden NV-toppar vid P17, varefter den återinträdes. Näthinnan är helt revascularized och NV är helt regressed av P23 – P25 (Figur 2A)2,3.
Råtta OIR-modellen (med varierande nivåer av O2) beskrevs först på 1990-talet som visar att varierande O2-nivåer vid 80% och 40% orsakar mer uttalad NV än under 80% O2 konstant exponering17. Senare upptäcktes att den intermittenta hypoximodellen, där O2 cyklas från hyperoxi (50%) hypoxi (10-12 %), orsakar ännu mer NV än 80/40% O2 modell18. I 50/10% -modellen utsätts råttvalpar för 50% i 24 timmar, följt av 24 timmar i 10% O2. Dessa cykler fortsätter fram till P14, då råttvalparna återgår till normoxiska förhållanden (figur 1B). Liksom hos humana ROP- patienter utvecklas de avaskulära områdena i råttmodellen till näthinnans periferi på grund av omogna näthinnan Vaskulär plexus (figur 3).
I båda modellerna är de viktigaste parametrarna som vanligtvis kvantifieras storleken på AVA och NV. Dessa parametrar analyseras vanligtvis från näthinneplatta fästen där endotelcellerna ärmärkta 4,16. Tidigare utvärderades mängden preretinal NV från retinal tvärsnitt genom att räkna blodkärl eller vaskulär cellkärnor som sträcker sig till glaskropp ovanför det inre begränsande membranet. Den största begränsningen av detta tillvägagångssätt är att det inte är möjligt att kvantifiera avgränsarna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Svårighetsgraden av sjukdomen fenotyp är beroende av både stammen och även leverantören i både mus och råtta OIR modeller23. Detta tyder på att det finns en bred genotypisk variabilitet i patologi utveckling. I allmänhet utvecklar pigmenterade gnagare allvarligare fenotyp än albino. Till exempel revascularizes retinal Vasculature av albino BALB/c revascularizes snabbt efter hyperoxia och utvecklar inte NV alls24. På samma sätt, hos råttor, visar pigmenterade Br…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen och Anne Kankkunen för utmärkt teknisk support. Detta arbete finansierades av Finlands Akademi, Päivikki och Sakari Sohlbergs stiftelse, Tammerfors tuberkulosstiftelse, Finlands medicinska stiftelse, Pirkanmaa sjukhusdistriktets forskningsstiftelse och Tammerfors universitetssjukhusforskningsfond.
Materials
| 33 gauge, Small Hub RN Needle | Hamilton Company | 7803-05, 10mm, 25°, PS4 | For intravitreal injection |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For image analysis | |
| Air pump air100 | Eheim GmbH & Co. KG. | 143207 | For inhalation anaesthesia |
| Anaesthesia unit 410 AP | Univentor Ltd. | 2360309 | For inhalation anaesthesia |
| AnalaR NORMAPUR Soda lime | VWR International Ltd | 22666.362 | For CO2 control during model induction |
| Attane Vet 1000 mg/g | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 17 05 79 | For inhalation anaesthesia |
| Brush | For preparation of flat mounts | ||
| Carbon dioxide gas | For sacrifice | ||
| Celeris D430 ERG system | Diagnosys LLC | 121 | For in vivo ERG |
| Cell culture dishes | Greiner Bio-One International GmbH | 664 160 | For preparation of flat mounts |
| Cepetor Vet 1 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 08 78 96 | For anaesthesia |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 15165452 | For preparation of flat mounts |
| O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier | Coy Laboratory Products | Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system | |
| E702 O2 sensor | BioSphenix, Ltd. | E207, 1801901 | For oxygen level measurement |
| Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT) | Bioptigen, Inc. | BPN000668 | For in vivo imaging |
| Eye spears | Beaver-Visitec International, Inc. | 0008685 | For intravitreal injection and in vivo imaging |
| Flexilux 600LL Cold light source | Mikron | 11140 | For intravitreal injection or tissue collection |
| Fluorescein sodium salt | Merck KGaA | F6377-100G | For in vivo imaging |
| Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter) | UNO Roestvaststaal BV | GEX 17015249 | For inhalation anaesthesia |
| Glass syringe, Model 65 RN | Hamilton Company | 7633-01 | For intravitreal injection |
| HRA2 Retina angiograph (FA) | Heidelberg Engineering GmbH | Spec-KT-05488 | For in vivo imaging |
| Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | I21411 | For labeling retinal vasculature on flat mounts |
| Ketaminol Vet 50 mg/mL | Intervet International B.V. | vnr 51 14 85 | For anaesthesia |
| Medicinal Oxygen gas | For disease model induction | ||
| Mice C57BL/6JRj | Janvier Labs | Also other strains possible | |
| Microscope slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | For preparation of flat mounts |
| Minims Povidone Iodine 5% (unit) | Bausch & Lomb U.K Limited | vnr 24 11 304 | For intravitreal injection |
| Nitrogen gas | For disease model induction (rat) | ||
| Oftan Chlora 10 mg/g | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 01 11 | For intravitreal injection |
| Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 43 | For in vivo ERG |
| Oftan Obucain 4 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 55 03 50 | For intravitreal injection |
| Oftan Tropicamid 5 mg/ml | Santen Pharmaceutical Co., Ltd. | vnr 04 12 36 | For in vivo imaging |
| ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 803 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber | BioSphenix, Ltd. | 538 | For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system |
| Rats CD(SD) | Charles River Laboratories | Also other strains possible | |
| Revertor 5 mg/mL | VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY | vnr 13 04 97 | For anaesthesia reversal |
| Silica gel | For humidity control during model induction | ||
| Systane Ultra 10ml | Alcon | Tamro 2050250 | For hydration of the eye |
| Systane Ultra unit 0.7ml | Alcon | Tamro 2064871 | For hydration of the eye |
| Transfer pipette | Thermo Fisher Scientific | 1343-9108 | For preparation of flat mounts |
| VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven | VWR | VL180S 170301 | For drying silica gel |
| VisiScope SZT350 Stereomicroscope | VWR | 481067 | For intravitreal injection or tissue collection |
Referências
- Chase, J. The evolution of retinal vascularization in mammals. A comparison of vascular and avascular retinae. Ophthalmology. 89 (12), 1518-1525 (1982).
- Sun, Y., Smith, L. E. H. Retinal vasculature in development and diseases. Annual Review of Vision Science. 4, 101-122 (2018).
- Vähätupa, M., Järvinen, T. A. H., Uusitalo-Järvinen, H. Exploration of oxygen-induced retinopathy model to discover new therapeutic drug targets in retinopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 873 (2020).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (6), 2813-2826 (2010).
- Benjamin, L. E., Hemo, I., Keshet, E. A plasticity window for blood vessel remodelling is defined by pericyte coverage of the preformed endothelial network and is regulated by PDGF-B and VEGF. Development. 125 (9), 1591-1598 (1998).
- Bashinsky, A. L. Retinopathy of prematurity. North Carolina Medical Journal. 78 (2), 124-128 (2017).
- Ludwig, C. A., Chen, T. A., Hernandez-Boussard, T., Moshfeghi, A. A., Moshfeghi, D. M. The epidemiology of retinopathy of prematurity in the united states. Ophthalmic Surgery, Lasers and Imaging Retina. 48 (7), 553-562 (2017).
- Hartnett, M. E. Pathophysiology and mechanisms of severe retinopathy of prematurity. Ophthalmology. 122 (1), 200-210 (2015).
- Liu, C. H., Wang, Z., Sun, Y., Chen, J. Animal models of ocular angiogenesis: From development to pathologies. FASEB Journal. 31 (11), 4665-4681 (2017).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia; etiology and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 35 (3), 301-311 (1952).
- Szewczyk, T. S. Retrolental fibroplasia and related ocular diseases; classification, etiology, and prophylaxis. American Journal of Ophthalmology. 36 (10), 1336-1361 (1953).
- Gerschman, R., Nadig, P. W., Snell, A. C., Nye, S. W. Effect of high oxygen concentrations on eyes of newborn mice. American Journal of Physiology. 179 (1), 115-118 (1954).
- Gyllnesten, L. J., Hellström, B. E. Experimental approach to the pathogenesis of retrolental fibroplasia. III. changes in the eye induced by exposure of newborn mice to general hypoxia. British Journal of Ophthalmology. 39 (7), 409-415 (1955).
- Curley, F. J., Habegger, H., Ingalls, T. H., Philbrook, F. R. Retinopathy of immaturity in the newborn mouse after exposure to oxygen imbalances. American Journal of Ophthalmology. 42 (3), 377-392 (1956).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: A model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4 (11), 1565-1573 (2009).
- Penn, J. S., Tolman, B. L., Lowery, L. A. Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (3), 576-585 (1993).
- Penn, J. S., Henry, M. M., Tolman, B. L. Exposure to alternating hypoxia and hyperoxia causes severe proliferative retinopathy in the newborn rat. Pediatric Research. 36 (6), 724-731 (1994).
- Ritter, M. R., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the mouse intraocular vasculature during development and disease. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3021-3026 (2005).
- Xiao, S., et al. Fully automated, deep learning segmentation of oxygen-induced retinopathy images. Journal of Clinical Investigation Insight. 2 (24), 97585 (2017).
- Mazzaferri, J., Larrivee, B., Cakir, B., Sapieha, P., Costantino, S. A machine learning approach for automated assessment of retinal vasculature in the oxygen induced retinopathy model. Scientific Reports. 8 (1), 22251-22257 (2018).
- Kim, C. B., D’Amore, P. A., Connor, K. M. Revisiting the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Eye and Brain. 8, 67-79 (2016).
- Barnett, J. M., Yanni, S. E., Penn, J. S. The development of the rat model of retinopathy of prematurity. Documenta Ophthalmologica. 120 (1), 3-12 (2010).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. Journal of Clinical Investigation. 116 (12), 3266-3276 (2006).
- Floyd, B. N., et al. Differences between rat strains in models of retinopathy of prematurity. Molecular Vision. 11, 524-530 (2005).
- Scott, A., Powner, M. B., Fruttiger, M. Quantification of vascular tortuosity as an early outcome measure in oxygen induced retinopathy (OIR). Experimental Eye Research. 120, 55-60 (2014).
- Walsh, N., Bravo-Nuevo, A., Geller, S., Stone, J. Resistance of photoreceptors in the C57BL/6-c2J, C57BL/6J, and BALB/cJ mouse strains to oxygen stress: Evidence of an oxygen phenotype. Current Eye Research. 29 (6), 441-447 (2004).
- Chan, C. K., et al. Differential expression of pro- and antiangiogenic factors in mouse strain-dependent hypoxia-induced retinal neovascularization. Laboratory Investigation. 85 (6), 721-733 (2005).
- Stahl, A., et al. Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. American Journal of Pathology. 177 (6), 2715-2723 (2010).
- Liegl, R., Priglinger, C., Ohlmann, A. Induction and readout of oxygen-induced retinopathy. Methods in Molecular Biology. 1834, 179-191 (2019).
- Holmes, J. M., Duffner, L. A. The effect of postnatal growth retardation on abnormal neovascularization in the oxygen exposed neonatal rat. Current Eye Research. 15 (4), 403-409 (1996).
- Holmes, J. M., Zhang, S., Leske, D. A., Lanier, W. L. The effect of carbon dioxide on oxygen-induced retinopathy in the neonatal rat. Current Eye Research. 16 (7), 725-732 (1997).
- Heiduschka, P., Plagemann, T., Li, L., Alex, A. F., Eter, N. Different effects of various anti-angiogenic treatments in an experimental mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Clinical and Experimental Ophthalmology. 47 (1), 79-87 (2019).
- Tokunaga, C. C., et al. Effects of anti-VEGF treatment on the recovery of the developing retina following oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1884-1892 (2014).
- Tokunaga, C. C., Chen, Y. H., Dailey, W., Cheng, M., Drenser, K. A. Retinal vascular rescue of oxygen-induced retinopathy in mice by norrin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (1), 222-229 (2013).
- Vähätupa, M., Uusitalo-Järvinen, H., Järvinen, T. A. H., Uusitalo, H., Kalesnykas, G. Intravitreal injection of PBS reduces retinal neovascularization in the mouse oxygen-induced retinopathy model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. Abstract Issue. 57 (12), 3649 (2016).
- Penn, J. S., et al. Angiostatic effect of penetrating ocular injury: Role of pigment epithelium-derived factor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (1), 405-414 (2006).
- Becker, S., Wang, H., Stoddard, G. J., Hartnett, M. E. Effect of subretinal injection on retinal structure and function in a rat oxygen-induced retinopathy model. Molecular Vision. 23, 832-843 (2017).
- Sophie, R., et al. Aflibercept: A potent vascular endothelial growth factor antagonist for neovascular age-related macular degeneration and other retinal vascular diseases. Biological Therapy. 2, (2012).
- Mezu-Ndubuisi, O. J. In vivo angiography quantifies oxygen-induced retinopathy vascular recovery. Optometry and Vision Science. 93 (10), 1268-1279 (2016).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., et al. In vivo retinal vascular oxygen tension imaging and fluorescein angiography in the mouse model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6968-6972 (2013).
- Dailey, W. A., et al. Ocular coherence tomography image data of the retinal laminar structure in a mouse model of oxygen-induced retinopathy. Data in Brief. 15, 491-495 (2017).
- Mezu-Ndubuisi, O. J., Taylor, L. K., Schoephoerster, J. A. Simultaneous fluorescein angiography and spectral domain optical coherence tomography correlate retinal thickness changes to vascular abnormalities in an in vivo mouse model of retinopathy of prematurity. Journal of Ophthalmology. 2017, 9620876 (2017).
- Pinto, L. H., Invergo, B., Shimomura, K., Takahashi, J. S., Troy, J. B. Interpretation of the mouse electroretinogram. Documenta Ophthalmologica. 115 (3), 127-136 (2007).
- Nakamura, S., et al. Morphological and functional changes in the retina after chronic oxygen-induced retinopathy. PLoS One. 7 (2), 32167 (2012).
- Dorfman, A. L., Polosa, A., Joly, S., Chemtob, S., Lachapelle, P. Functional and structural changes resulting from strain differences in the rat model of oxygen-induced retinopathy. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (5), 2436-2450 (2009).
- Vähätupa, M., et al. SWATH-MS proteomic analysis of oxygen-induced retinopathy reveals novel potential therapeutic targets. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (8), 3294-3306 (2018).
- Campos, M., Amaral, J., Becerra, S. P., Fariss, R. N. A novel imaging technique for experimental choroidal neovascularization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5163-5170 (2006).
- Yanez, C. O., et al. Deep Vascular Imaging in Wounds by Two-Photon Fluorescence Microscopy. PLos One. 8 (7), 67559 (2013).
- Wickramasinghe, L. C., et al. Lung and eye disease develop concurrently in supplemental oxygen-exposed neonatal mice. American Journal of Pathology. , 30287 (2020).
